通过培养重组微生物制备软骨素，所述重组微生物通过使产生软骨素的果糖基化衍生物的微生物中编码负责将果糖残基加至线性软骨素多糖的酶的基因失活而获得。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是申请日为2011年6月1日、申请号为201180033969. 3、专利技术名称为"软 骨素的生物技术制备"的专利技术专利申请的分案申请。 专利技术目的 本专利技术涉及一种产生软骨素的新的重组微生物以及方法。 在本专利技术中，术语软骨素指定义为线性糖胺聚糖的线性多糖，其由通过 β 1-3 (GlcUA - GalNAc)键和 β 1-4 (GalNAc - GlcUA)键连接的 D-糖醛酸（GlcUA)和 N-乙 酰-D-半乳糖胺（GalNAc)的交替残基构成。 专利技术背景 硫酸软骨素为糖胺聚糖，其中糖醛酸（GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺（GalNAc) 经β 1-3键和β 1-4键分别地线性和交替连接，以形成在其GalNAc残基中进行不同程度的 硫酸化的线性多糖链。 其存在于动物中，在软骨和结缔组织中，在细胞黏着、组织再生、神经延伸等中起 到重要作用。 从非动物源制备软骨素是通向非动物来源的硫酸软骨素制备的重要且期望的步 骤。 已有的专利文献描述了几种制备非动物来源的软骨素的方法。 此外，已经克隆并测序了来自动物和微生物的几种软骨素合酶基因。 已经提供了使用导入来自多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida)的软骨素合 酶基因的重组革兰氏阳性芽孢杆菌制备软骨素的方法（US2007/0281342A1)。 另一专利技术描述了通过将来自大肠杆菌05:K4:H4(Escherichia coli 05:K4:H4A) 的kfoC和kfoA基因导入产生UDP-糖醛酸的细菌中制备软骨素的方法（W02008/133350)。 另一专利技术描述了包括大肠杆菌05:K4:H4软骨素合酶和前体反应的酶体系中的体 外软骨素合成（US2009/0263867A1)。 已知大肠杆菌05:K4:H4能够产生与软骨素具有相同主链结构的荚膜多 糖（K4多糖），果糖残基连接于其上的GlcUA残基（参见，例如N. Volpi，Glycocon j. J.，25:451-457(2008))。因此，K4多糖由重复的三糖单元组成，所述三糖单元包括经 β 1-3 (GlcUA - GalNAc)连接的D-糖醛酸（GlcUA)部分和N-乙酰-D-半乳糖胺（GalNAc) 部分以及结合于所述GlcUA残基的C3-羟基的果糖残基。因此，果糖残基构成所得线性多 糖的分支。 通过酸性条件中的水解处理已经实现果糖残基的去除 (N. Volpi, Electrophoresis 25, 692-696(2004)) 〇 尽管已经广泛研宄了大肠杆菌05:K4:H4荚膜抗原基因簇以及产生组成K4线性多 糖的糖的代谢途径，迄今为止，还没有发现负责将果糖部分加至线性多糖得到K4多糖的糖 基转移酶活性。 本专利技术的新特征为通过失活基因获得的重组微生物直接制备高分子量软骨素，所 述基因编码负责将果糖残基加至软骨素主链的酶，从而消除了将K4多糖进行结合于GlcUA 部分的果糖残基的水解去除来获得软骨素的需要。 专利技术详述 本专利技术的目的为提供产生软骨素的重组微生物，所述软骨素定义为分别由通过 β 1-3键和β 1-4键连接的D-糖醛酸（GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺（GalNAc)的交替残 基组成的线性糖胺聚糖，其特征在于，在所述微生物中编码负责将果糖残基加至软骨素主 链的酶的基因被失活。 因此，根据本专利技术的一个方面，提供一种产生软骨素的重组微生物，其特征在于， 所述微生物通过将原始存在于其中的基因进行失活而获得，所述基因编码负责将果糖残基 加至线性软骨素主链的蛋白质，所述失活包括全部或部分缺失或取代所述基因或通过插入 另外的核苷酸序列进行干扰。 根据本专利技术的一个优选方面，通过失活编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的基 因获得的本专利技术的重组微生物来自属于大肠杆菌种的细菌、优选地属于包括公知的血清型 如Κ1、Κ5、Κ7、Κ12的2类K抗原。 尽管根据本专利技术的代表性实施方案，具有产生软骨素能力的重组微生物 来自大肠杆菌05: Κ4: Η4,可以使用任何属于K抗原类的微生物，不管其与大肠杆 菌05:Κ4:Η4是否共享任何基因同源性。所述微生物的实例包括属于嗜血杆菌属 的细菌，如流感嗜血杆菌（Η. influenzae)(Branefors-Helander Ρ.，Carbohydr. Res.，Vol. 88, Jan 15, 1981)，弯曲杆菌属的细菌，如空肠弯曲杆菌（C. jejuni) (McNally DJ,Jarrell HC, Li J,Khieu NH,Vinogradov E,Szymanski CM, Brisson JR，FEBS J.，Vol. 272, No 17, 4407-4422, S印t. 2005)，粘球藻属的细菌，如胶质粘球 藻(G. gelatinosa) (Raungsomboon S, Chidthaisong A, Bunnag B, Inthorn D, Harvey NW, Water Res. , Vol. 40, No 20, 3759-3766, Dec. 2006)和弧菌属的细菌，如霍乱弧菌 (V. cholerae)(Knirel YA, Widmalm G, Senchenkova SN,Jansson PE, Weintraub A, Eur. J. Biochem. , Vol. 247, 402-410, July 1997) 〇 更优选地，产生软骨素的本专利技术的重组微生物所来自的细菌为大肠杆菌血清型 05: K4: H4,其含有编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的kfoE基因。 已知kfoE位于大肠杆菌（E. coli)K4抗原基因簇（GenBank AB079602)内，该基因 簇含有本专利技术人发现的基因，与来自其它微生物的、可能参与细菌荚膜产生的基因具有显 著同源性（T. Ninomiya，N. Sugiura，A. Tawada，K. Sugimoto, H. Watanabe and K. Kimata，J. Boil. Chem.，Vol. 277, No 24, 21567-75, June 14, 2002) 〇 最优选用于获得本专利技术的重组微生物的细菌为大肠杆菌05:K4:H4菌株U1-41可 由ATCC(美国典型培养物保藏中心，Manassas, Virginia, US)获得，保藏号ATCC23502。 根据本专利技术的代表性实施方案，所述重组微生物为产生软骨素的微生物，其中进 行失活的基因为编码选自以下（A)、（B)和（C)的蛋白质的基因： ⑷包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋白质 (B)包含经缺失、取代或插入一个或多个氨基酸修饰的SEQ ID NO 2的氨基酸序列 且具有果糖基转移酶活性的蛋白质。 (C)包含与SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有至少50%同源性的氨基酸序列且具有 果糖基转移酶活性的蛋白质。 根据本专利技术的微生物为其中失活的基因为kfoE基因或选自以下（a)、（b)和（c) 的DNA的微生物： (a)包含SEQ ID NO 1的核苷酸序列的DNA (b)与包含互补于SEQ ID NO 1的核苷酸序列的DNA杂交且编码具有果糖基转移 酶活性的本文档来自技高网...
【技术保护点】
产生软骨素的重组微生物，所述软骨素定义为由经β1‑3(GlcUA→GalNAc)键和β1‑4(GalNAc→GlcUA)键连接的D‑糖醛酸(GlcUA)和N‑乙酰‑D‑半乳糖胺(GalNAc)的交替残基组成的线性糖胺聚糖，其特征在于，所述重组微生物来自属于选自埃希氏菌属、嗜血杆菌属、弯曲杆菌属、粘球藻属和弧菌属的属的K抗原类的细菌，所述细菌能够产生果糖基化的软骨素，并且在所述细菌中编码负责将果糖残基加至线性软骨素主链的酶的原始存在的kfoE基因被失活，所述失活通过全部或部分缺失或取代所述基因或者通过插入另外的核苷酸序列的干扰进行，其中所述kfoE基因编码选自以下的蛋白质：(A)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋白质；(B)包含经缺失、取代或插入一个或多个氨基酸修饰的SEQ ID NO 2的氨基酸序列且具有果糖基转移酶活性的蛋白质；和(C)包含与SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有至少50％的同源性的氨基酸序列且具有果糖基转移酶活性的蛋白质。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A·特里利，I·布泻洛，S·戴利，F·巴加廷，
申请(专利权)人：灵知股份公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT
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