包含NADPH依赖性酶的重组微生物及其生产方法技术

本发明专利技术提供了重组一氧化碳营养梭菌微生物，其相对于亲代微生物具有增加的NADPH的总体利用。此外，本发明专利技术提供了产生重组一氧化碳营养梭菌微生物的方法，所述重组一氧化碳营养梭菌微生物展示相对于亲代微生物增加的NADPH利用。尤其，本发明专利技术涉及增加重组一氧化碳营养梭菌微生物中的NADPH的总体利用，以便增加微生物的至少一种发酵产物的产生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及选择酶以优化通过发酵产生期望的化合物的方法。更具体地，但是不 是排他性地，本专利技术涉及发酵途径和代谢工程化中的辅助因子平衡。 背景 还原等价物比如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)是重要的辅酶，用于比如氧化还原酶反应的酶氧化还原反应并且出现在所有活细 胞中。通常认为的是NADPH库远小于NADH的库（G. N. Bennett&San，2009)。在葡萄糖上生 长的大肠杆菌中NADH库超过NADPH库的20倍（B. D. Bennett等，2009)。该低的NADPH可 用性限制了许多生物合成反应和生物转化，尤其在发酵过程中（R Poulsen等，2005)。酶对 NADPH的偏好可限制期望产物的产生（G. N. Bennett&San，2009)。当将新反应和途径工程化 至微生物时这是个问题，并且是产生包括生物燃料、化学品、氨基酸或维生素的化合物的有 效生产平台的主要障碍之一（Chemler，Fowler，McHugh，&Koffas，2010)。 然而，代谢工程化已经成功表明可能的情况下通过限制、避免或绕过NADPH依赖 性反应而用于产生宽范围的燃料和化学品（Peralta_Yahya&Keasling，2010)。可选地，已经 使用消耗能量转氢酶，其在NADH和NADPH库之间互变。实现成功代谢工程化的另一策略是 消除竞争NADPH依赖性反应。尽管这些进步，但是这样新的策略通常以生产产率和/或生 长速度为代价追求（Auriol，Bestel-Corre，Claude，Soucaille，&Meynial_Salles，2011) 〇 此外，它们仅仅通过许多修饰的大量工程化工作是可能的（S.M. Ma等，2011)。因此这些 努力仅仅局限于遗传上易处理的生物体，比如大肠埃希杆菌和酿酒酵母（Aaccharomyces cerevisiae) (Peralta_Yahya&Keasling，2010)。这些生物体是受限的，因为它们仅仅在糖 上生长。因此，它们的商业用途和活力就土地利用、食品安全、供应的波动和环境问题而言 具有明显的缺点。 -氧化碳营养梭菌为大肠杆菌和酿酒酵母提供了可选方案，并且能够在废 气和合成气上生长。有少数重组一氧化碳营养梭菌的例子，其具有有限数量的修饰 (Schiel-Bengelsdorf&DUrre，2012)。所有已知的例子使用NADH-依赖性反应。 本专利技术的目的是克服或减少现有技术的一个或多个缺点，或至少为公众提供有用 选择。
技术实现思路
在第一方面中，本专利技术提供了重组一氧化碳营养梭菌微生物，其适于表达一个或 多个外源NADPH-依赖性酶，和/或适于过表达一个或多个内源NADPH-依赖性酶，选择所述 酶使得当表达外源酶时，和/或过表达内源酶时，相对于亲代微生物，该微生物对NADPH的 总体使用增加。 在第二方面中，本专利技术提供了产生重组一氧化碳营养梭菌微生物的方法，所述重 组一氧化碳营养梭菌微生物相对于亲代微生物展示增加的NADPH使用，方法包括： a.选择一个或多个外源和/或内源NADPH-依赖性酶； b.转化亲代微生物，以产生重组微生物，其适于表达一个或多个NADPH-依赖性外 源酶，和/或过表达一个或多个NADPH-依赖性内源酶。微生物中任何一个或多个NADPH-依 赖性酶的表达或过表达使得相对于亲代微生物NADPH的使用总体增加。 本专利技术也提供了通过第二方面的方法制备的重组一氧化碳营养梭菌。 在第一或第二方面的【具体实施方式】中，一个或多个NADPH-依赖性酶包括氢 化酶（例如 Seq.ID 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、YP_003781016、 ΥΡ_003781017、ΥΡ_003778879、ΥΡ_003779640、ΥΡ_003779893、ΥΡ_003780193 或其任何一个 的功能等价变体），甲酸盐脱氢酶（例如ΑΕΙ90721、ΑΕΙ90723、ΑΕΙ90725、ΥΡ_003779063、 ΥΡ_003778871、ΥΡ_003780168、ΑΕΙ90722、ΑΕΙ90724、ΑΕΙ90726 或其任何一个的功能等价变 体）或亚甲基-THF-脱氢酶（例如ΑΕΙ90753、ΥΡ_003781891、ΑΕΙ90771或其任何一个的功 能等价变体）。 在第一或第二方面的【具体实施方式】中，一个或多个NADPH-依赖性酶以NADH-和 NADPH-依赖性同种型存在并且重组微生物适于表达和/或过表达NADPH-依赖性同种型。 在具体的实施方式中，微生物适于表达和/或过表达NADPH-依赖性同种型，同时 相应的NADH-依赖性同种型的表达当与NADPH-依赖性同种型的表达比较时，基本上不变、 下降或展示相当小的增加。在具体的实施方式中，调整微生物，从而一个或多个NADH-依 赖性同种型的表达与亲代微生物相比减弱或敲除。在一个实施方式中，通过修饰编码一个 或多个NADH-依赖性酶的核酸或用编码NADPH-依赖性同种型的一个或多个核酸替换编码 NADH-依赖性同种型的一个或多个核酸，表达减弱或敲除。 在第一或第二方面的具体的实施方式中，NADPH的总体使用的增加包括通过其中 一个或多个NADPH-依赖性酶是活性的途径中NADPH通量的增加。在具体的实施方式中，通 量增加至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少100%。通过途径的通量可通过代谢 分子和产物的水平测量（代谢组学）（Patti，Yanes，&Siuzdak，2012)和/或如C13的标记 实验测量（通量组学）（Niittylae，Chaudhuri，Sauer，&Frommer，2009 ;Tang 等，无日期）。 在第一或第二方面的一个【具体实施方式】中，NADPH的总体使用的增加在使用中使 得微生物产生一个或多个产物的效率增加。 在具体的实施方式中，以NADPH-和NADH-依赖性同种型存在的一个或多个酶 是羟甲基戊二酸-CoA (HMG-CoA)还原酶，和包括NADPH-依赖性同种型（EC I. I. 1. 34 ; GO :0004420 ;例如酿酒酵母：DAA09822. I ;BK006946. 2 :115734. . 118898 或其任何一个的 功能等价变体）和NADH-依赖性同种型（EC1. I. 1. 88 ;G0 :0042282 ;例如迈氏假单胞菌： P13702. 1或其任何一个的功能等价变体）。 在具体的实施方式中，以NADPH-和NADH-依赖性同种型存在的一个或多个酶 是羟基丁酰-CoA脱氢酶/乙酰乙酰-CoA还原酶/3-羟基丁酰-CoA水合酶，并且包括 NADPH-依赖性同种型 phaB(EC :1. I. L 36 ;G0 :0018454 ;例如来自 Ralstonia eutropha : YP_725942. 1，Gene ID :4249784或其任何一个的功能等价变体），NADPH依赖性phaj(EC 4. 2. 1. 119 ;例如来自点状产气单胞菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组一氧化碳营养梭菌微生物，其适于表达至少一种外源NADPH‑依赖性酶或适于过表达至少一种内源NADPH‑依赖性酶，选择所述酶使得当表达外源酶或过表达内源酶时，微生物的NADPH的总体利用相对于亲代微生物增加。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·米勒，M·科普克，
申请(专利权)人：朗泽科技新西兰有限公司，
类型：发明
国别省市：新西兰;NZ