水蛭素抗凝血酶活性的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，将已知一定质量的含有未知活性的水蛭素与足量的凝血酶反应后，在交联剂BS3作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第一混合体系，经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素-凝血酶化合物的质量，根据水蛭素与凝血酶以质量比为1∶5结合得到水蛭素-凝血酶化合物得出参与反应的有效凝血酶的质量，再根据凝血酶中有效凝血酶的质量分数以及水蛭素的质量计算得出该一定质量的水蛭素抑制凝血酶的活性值即为水蛭素抗凝血酶的活性值。本发明专利技术的方法操作简单、准确性好、投入和设备要求低。

【技术实现步骤摘要】
水蛭素抗凝血酶活性的测定方法
本专利技术涉及医药检验领域，具体涉及一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法。
技术介绍
由于心脏和脑血管疾病的增加，水蛭素作为一种有效的抗血栓药物，在抑制凝血酶方面表现出的巨大潜力，已经吸引了越来越多的关注，天然水蛭素可以从养殖水蛭(Hirudomedicinalis)的唾液中提取。为了满足日益增长的需求，自1986年以来开展了重组水蛭素的研究。水蛭素是一种酸性多肽，具有64-69个氨基酸，分子量为7千道尔顿，等电点为3.8。水蛭素性状类似蝌蚪，具有两个功能域：n端为头部和c为端尾，在c端第49-65氨基酸处有丰富的带负电的残留物。凝血酶有三个功能域：催化部位、疏水性部位(接近催化部位)和识别部位，凝血酶识别的部位富有阳性残留物。水蛭素对凝血酶结合包括两个步骤。首先，水蛭素的c端通过大量的离子键与凝血酶的识别位点结合，使凝血酶的结构发生改变，从而诱发了第二步：水蛭素的N端结构域通过结构匹配与凝血酶的疏水部位结合，在第二步中，凝血酶的催化部位由于与疏水性部位相邻而被水蛭素阻塞。这样的结合是快速且稳定的，可以灭活凝血酶，因为所有凝血酶功能域的屏蔽。因此，结合水蛭素的活动也可以描述为其抗凝血酶活性。目前，有很多方法来测试水蛭素活性。这些方法可以分为：(1)滴定法：采用纤维蛋白原或其他试剂被用作滴定和测试水蛭素结合活性的指标，该方法简易、省时、经济简便、应用广泛，但重复性和准确度不理想，受环境影响比较大。(2)光谱学法：在凝聚后或添加了放射追踪凝血酶底物后光散射的变化用于评估水蛭素的活性，光散射的变化后凝固或之后添加radio-labeled凝血酶底物用于评估水蛭素活性，该方法准确、稳定，但需要使用昂贵的专业散色荧光仪，且标准曲线的建立有可能产生误差。(3)免疫测定方法：水蛭素活性通过免疫沉淀反应和免疫印迹的方法被测量，该方法准确、稳定，有一定的再现性，但部分药品需要进口，价格昂贵。
技术实现思路
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本专利技术的专利技术人发现通过交联剂BS3固定水蛭素与凝血酶反应产生的水蛭素-凝血酶化合物，并通过SGS-PAGE与光密度扫描得出水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度变化可以准确计算水蛭素抗凝血酶的活性。基于这种发现，完成了本专利技术。本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种通过交联剂BS3固定水蛭素与凝血酶反应产生的水蛭素-凝血酶化合物，根据SGS-PAGE与光密度扫描计算水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，本专利技术的方法准确性好，检测使用的水蛭素样本量小、检测浓度低，本专利技术的方法操作简单，投入和设备要求都较低。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，将已知一定质量的含有未知活性的水蛭素与足量的凝血酶反应后，在交联剂作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第一混合体系，其中，所述交联剂为BS3，所述第一混合体系经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素-凝血酶化合物的质量，根据水蛭素与凝血酶以质量比为1:5结合得到水蛭素-凝血酶化合物得出参与反应的有效凝血酶的质量，再根据凝血酶中有效凝血酶的质量分数以及水蛭素的质量计算得出该一定质量的水蛭素抑制所述凝血酶的活性值即为水蛭素抗凝血酶的活性值。优选的是，所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，所述凝血酶中有效凝血酶的质量分数的测定方法如下：将足量的水蛭素与已知一定质量的凝血酶反应后，在交联剂BS3作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第二混合体系，经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据第二混合体系中水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素-凝血酶化合物的质量，进而得到有效凝血酶的质量，其与已知一定质量的凝血酶的质量比即为所述凝血酶中有效凝血酶的质量分数。优选的是，所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，将多组不同质量的含有未知活性的水蛭素与恒定量且足量的凝血酶反应后得到一一对应的多组第一混合体系，从而得出多组水蛭素抗凝血酶的活性值，求其均值，即得水蛭素抗凝血酶的活性。本专利技术还提供了一种方案，一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，将一系列梯度质量的含有未知活性的水蛭素与恒定量的凝血酶反应后，在交联剂BS3作用下进行交联反应，终止交联后得到一一对应的含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第三混合体系，经电泳后根据未反应的水蛭素、未反应的凝血酶以及水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带的变化确定水蛭素抗凝血酶活性的范围。本专利技术还提供了一种方案，一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，包括以下步骤：步骤一、向标记为1-8的管中依次添加结合缓冲液10.5μL、9.5μL、8.5μL、7.5μL、6.5μL、5.5μL、4.5μL和3.5μL，再依次添加水蛭素溶液1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL和8μL，于8个管中分别加入2μL凝血酶溶液，混匀后，将其均置于37℃下水浴5min，所述结合缓冲液为质量分数为0.9％的氯化钠溶液；所述水蛭素溶液的浓度为0.2mg/mL，所述凝血酶溶液是以质量分数为0.9％氯化钠溶液为溶剂配制的凝血酶蛋白浓度为4.8mg/mL即3NIH/μL的溶液；步骤二、向8个管中分别加入1.5μL交联剂BS3溶液，于室温下交联反应30min，所述交联剂BS3溶液由12.5mmolBS3和20mmol磷酸钠溶解于1.5μL0.9％的氯化钠溶液得到的溶液；步骤三、向8个管中分别加入1μL终止缓冲溶液，反应15min以终止交联反应，所述终止缓冲溶液由0.8mmolTris和0.8mmol甘氨酸溶解于1μL0.9％的氯化钠溶液中，并用盐酸调节其pH为7.5；步骤四、向8个管中分别加入4μL的5％SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后每管取10μL进行SDS-PAGE分析，得出标记为6-8的管中样品经SDS-PAGE分析得出的水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带的密度未发生变化，因此得出水蛭素抗凝血酶的活性范围在标记为5的管与标记为6的管之间，即抑制3NIH凝血酶需要的水蛭素的质量为0.5-0.6μg，即水蛭素抗凝血酶的活性为5000-6000ATU/mg。优选的是，所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，在8个管中的样品进行SDS-PAGE分析后以0.1μg和1μg牛血清白蛋白作为对照，进行光密度扫描检测得到8个管中对应的水蛭素-凝血酶化合物的质量依次为0.45μg、0.91μg、1.36μg、1.82μg、2.27μg、2.4μg、2.4μg和2.4μg，由标记为6-8的管中水蛭素-凝血酶化合物的质量得出凝血酶溶液中有效凝血酶的质量分数为41.7％，由此得出标记为1-5的管中水蛭素抗凝血酶的活性为5625ATU/mg、5687.5ATU/mg、5666.7ATU/mg、5687.5ATU/mg和5675ATU/mg，求其平均值得到水蛭素抗凝血酶的活性为5668ATU/mg。优选的是，所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，所述5％SDS-PAGE蛋白上样缓冲液由蒸馏水、30％的Acr-Bis、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，将已知一定质量的含有未知活性的水蛭素与足量的凝血酶反应后，在交联剂作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素‑凝血酶化合物的第一混合体系，其中，所述交联剂为BS3，所述第一混合体系经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据水蛭素‑凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素‑凝血酶化合物的质量，根据水蛭素与凝血酶以质量比为1∶5结合得到水蛭素‑凝血酶化合物得出参与反应的有效凝血酶的质量，再根据凝血酶中有效凝血酶的质量分数以及水蛭素的质量计算得出该一定质量的水蛭素抑制所述凝血酶的活性值即为水蛭素抗凝血酶的活性值。

【技术特征摘要】
1.一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，将已知一定质量的含有未知活性的水蛭素与足量的凝血酶反应后，在交联剂作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第一混合体系，其中，所述交联剂为BS3，所述第一混合体系经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素-凝血酶化合物的质量，根据水蛭素与凝血酶以质量比为1:5结合得到水蛭素-凝血酶化合物得出参与反应的有效凝血酶的质量，再根据凝血酶中有效凝血酶的质量分数以及水蛭素的质量计算得出该一定质量的水蛭素抑制所述凝血酶的活性值即为水蛭素抗凝血酶的活性值。2.如权利要求1所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，所述凝血酶中有效凝血酶的质量分数的测定方法如下：将足量的水蛭素与已知一定质量的凝血酶反应后，在交联剂BS3作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第二混合体系，经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据第二混合体系中水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素-凝血酶化合物的质量，进而得到有效凝血酶的质量，其与已知一定质量的凝血酶的质量比即为所述凝血酶中有效凝血酶的质量分数。3.如权利要求2所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，将多组不同质量的含有未知活性的水蛭素与恒定量且足量的凝血酶反应后得到一一对应的多组第一混合体系，从而得出多组水蛭素抗凝血酶的活性值，求其均值，即得水蛭素抗凝血酶的活性。4.一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，将一系列梯度质量的含有未知活性的水蛭素与恒定量的凝血酶反应后，在交联剂BS3作用下进行交联反应，终止交联后得到一一对应的含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第三混合体系，经电泳后根据未反应的水蛭素、未反应的凝血酶以及水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带的变化确定水蛭素抗凝血酶活性的范围。5.一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、向标记为1-8的管中依次添加结合缓冲液10.5μL、9.5μL、8.5μL、7.5μL、6.5μL、5.5μL、4.5μL和3.5μL，再依次添加水蛭素溶液1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL和8μL，于8个管中分别加入2μL凝血酶溶液，混匀后，将其均...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨剑，熊文朋，刘艳芳，修立辉，
申请(专利权)人：广西师范学院，
类型：发明
国别省市：广西;45