本发明专利技术提供了一种鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，它主要包括配置组织匀浆、测定蛋白质含量、在孵育夜中孵育、终止反应并计算含量几步。本发明专利技术的测定方法样品处理过程简单，只需在加入还原剂DTT的PBS缓冲液中匀浆即可，操作过程也比较简便，实验仪器仅需要高速冷冻离心机，紫外分光光度计，水浴锅和γ放射免疫计数仪即可。碘125标记物可在生物技术研究所定制合成，其半衰期较长，有利于实验的开展，测定结果可靠，具有很强的实用性。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了，它主要包括配置组织匀浆、测定蛋白质含量、在孵育夜中孵育、终止反应并计算含量几步。本专利技术的测定方法样品处理过程简单，只需在加入还原剂DTT的PBS缓冲液中匀浆即可，操作过程也比较简便，实验仪器仅需要高速冷冻离心机，紫外分光光度计，水浴锅和γ放射免疫计数仪即可。碘125标记物可在生物技术研究所定制合成，其半衰期较长，有利于实验的开展，测定结果可靠，具有很强的实用性。【专利说明】
本专利技术动物生理学和生物化学
，具体涉及。
技术介绍
目前关于脱碘酶活性测定的方法仅有一篇于1996年发表在ClinicalB1chemistry上的“一种用碘125标记的反三碘原腺甲氨酸为底物测定肝脏和肾脏中I型脱碘酶的方法” (Hotz, C.S., Belonje, B., Fitzpatrick, D.ff., L’ abbe, M.R., 1996.A Methodfor the Determinat1n of Type I 1dothyronine De1d nase Activity in Liver andKidney Usingl251-LabeIled Reverse Tri1dothyronine as a Substrate.ClinicalB1chemistry29, 451-456.)。但该文献没有介绍II型和III型脱碘酶的测定方法。国内外文献中有多篇涉及脱碘酶活性测定的内容，虽然都是利用放射性的碘标记物作为反应底物来测定脱碘酶的活性，但方法不尽相同，没有统一的标准。 脱碘酶是一种硒蛋白，存在于细胞质膜中，它们对甲状腺激素的代谢过程有着非常重要的调节作用，测定其活性对甲状腺功能的研究以及发病机理有重要作用。脱碘酶活性表示为:每分钟每毫克蛋白质释放出的I的皮摩尔数或发摩尔数。(pmol/fmol Ireleased.mg protein-1.minute—1)。根据不同的物理化学特性、组织分布、底物特异性和对抑制剂的敏感性，脱碘酶可以分为三种类型:I型脱碘酶(IDl)、II型脱碘酶(ID2)、111型脱碘酶(ID3)。这三种脱碘酶分别有着各自最适的反应底物。测定的方法是，用碘125标记相应的底物，经过一定时间的孵育之后，测定由脱碘酶脱下的碘离子的放射性强度，然后经过公式计算出脱碘酶的活性，脱碘酶的活性表示为每分钟每毫克蛋白质释放出的碘离子的发摩尔数。目前国内外还尚未见有测定鱼类组织中三种脱碘酶活性的试剂盒，也没有标准的测定方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是根据现有技术的不足提供一种动物组织中三种脱碘酶活性的测定方法，本测定方法操作简单方便，成本低，测定结果直接可靠。 本专利技术是通过如下技术方案实现的:，其步骤包括:(1)称取动物组织后用缓冲液将动物组织配制成质量浓度为1-2%的匀浆，并离心取上清夜；(2)测定所述上清液中蛋白质含量；(3)将所述上清液按照体积比1:1加入孵育液在37°C下孵育120min ;将缓冲液按照同样方法加入孵育液后在37°C下孵育120min作为对照组；测定I型脱碘酶活性的孵育液为50000cpm1251-rT3,0.1 μ M rT3，15mMDTT混合物；测定II型脱碘酶的孵育液为50000cpm1251-T4，lnM T4,30mM DTT混合物；测定III型脱碘酶的孵育液为150000cpm1251-T3，InM Ts,30mM DTT混合物；(4)加入BSA溶液终止反应后沉淀离心，取上清液用放射免疫计数仪分别测定总放射性及上清液的放射性cpm值，依据下述经验公式分别计算动物组织中三种脱碘酶活性: 【权利要求】1.，其步骤包括:(1)称取动物组织后用缓冲液将动物组织配制成质量浓度为1-5%的匀浆，并离心取上清夜；(2)测定所述上清液中蛋白质含量；(3)将所述上清液按照体积比1:1加入孵育液在37°C下孵育120min ;将缓冲液按照同样方法加入孵育液后在37°C下孵育120min作为对照组；测定I型脱碘酶活性的孵育液为50000cpm1251-rT3，0.1 μ M rT3，15mM DTT混合物；测定II型脱碘酶的孵育液为50000cpm1251-T4, InM T4，30mMDTT 混合物；测定III型脱碘酶的孵育液为 150000cpm1251-T3，InM T3, 30mM DTT混合物；(4)加入BSA溶液终止反应后沉淀离心，取上清液用放射免疫计数仪分别测定总放射性及上清液的放射性cpm值，依据下述经验公式分别计算动物组织中三种脱碘酶活性:其中:其中SCc = SC - BC ； BC:对照管的放射性计数； SC:样品管的放射性计数； SA:孵育液中反应底物的含量/TC ； TC:总放射性计数。2.根据权利要求1所述鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，其特征在于:所述缓冲液为0.1M的pH = 7.0的PBS缓冲液,其中含有2mM EDTA, IMm DTT03.根据权利要求1所述鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，其特征在于:所述步骤(4)中BSA溶液4°C的质量体积浓度为5 %的BSA溶液，BSA溶液的加入量与上清液的体积比为1:1。4.根据权利要求1所述鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，其特征在于:所述步骤(4)中加入BSA溶液后沉淀是加入了质量体积浓度为10%的TCA溶液，并在3500r/min下离心30min，TCA溶液的加入量与上清液的体积比为2:1。【文档编号】G01N33/573GK104165988SQ201410369496【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日 【专利技术者】李大鹏, 刘子栋 申请人:华中农业大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，其步骤包括：(1)称取动物组织后用缓冲液将动物组织配制成质量浓度为1‑5％的匀浆，并离心取上清夜；(2)测定所述上清液中蛋白质含量；(3)将所述上清液按照体积比1：1加入孵育液在37℃下孵育120min；将缓冲液按照同样方法加入孵育液后在37℃下孵育120min作为对照组；测定Ⅰ型脱碘酶活性的孵育液为50000cpm125I‑rT3，0.1μM rT3，15mM DTT混合物；测定Ⅱ型脱碘酶的孵育液为50000cpm125I‑T4，1nM T4，30mMDTT混合物；测定Ⅲ型脱碘酶的孵育液为150000cpm125I‑T3，1nM T3，30mM DTT混合物；(4)加入BSA溶液终止反应后沉淀离心，取上清液用放射免疫计数仪分别测定总放射性及上清液的放射性cpm值，依据下述经验公式分别计算动物组织中三种脱碘酶活性：其中：其中SCc＝SC－BC；BC：对照管的放射性计数；SC：样品管的放射性计数；SA：孵育液中反应底物的含量/TC；TC：总放射性计数。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李大鹏，刘子栋，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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