一种T4 DNA聚合酶活性测定方法技术

本发明专利技术公开了一种T4 DNA聚合酶活性测定方法，所述方法包括：在无dNTP存在的情况下，在以双链线性DNA模板为底物的反应体系中加入T4 DNA聚合酶，反应完成后检测双链DNA的相对量，由此测出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA聚合酶的外切酶活性与聚合酶活性相关，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。本发明专利技术通过便利地测量外切酶活性，利用T4 DNA聚合酶的外切酶活性与聚合酶活性的相关性测量聚合酶活性。与现有技术的方法相比，无放射性污染，操作简单快速，并且克服了外切酶活性对聚合酶活性测定的干扰，得到的结果因此更准确。

【技术实现步骤摘要】
-种T4 DNA聚合酶活性测定方法
本专利技术属于生化
，具体来说涉及一种Τ4 DNA聚合酶活性测定方法。
技术介绍
Τ4 DNA聚合酶由Τ4噬菌体聚合酶I基因编码，具有5'_3'聚合酶活性以及3'_5' 外切酶活性。T4 DNA聚合酶是基因工程技术中一种重要的工具酶，可用于双链DNA末端的 平滑化。在高通量测序（next generation sequencing)文库构建的过程中，片段化的DNA 末端首先需要用T4 DNA聚合酶平滑化，再经过T4多聚核苷酸激酶加磷酸后，才能与双链 DNA接头进行连接。 标准的T4 DNA聚合酶测活方法采用放射性同位素法。T4 DNA聚合酶可以催化将 32P标记的dNTP掺入到小牛胸腺DNA中。经过TCA沉淀、whatman滤纸过滤，通过测定酸不 溶性物质中放射性的含量，计算聚合酶活性。这种方法易产生放射性污染，且步骤多、周期 长，难以实现高通量、自动化。 Seville 等（Biotechniques· 1996 Oct ;21 (4) : 664)建立了一种基于突光的 DNA 聚合酶活性测定方法，其原理如图1所示。 DNA聚合酶可以M13单链环状DNA为模板催化聚合反应，生成M13双链环状DNA。 双链环状DNA产物可以被双链DNA特异性的picogreen染料结合，产生荧光，从而测定DNA 聚合酶活性。 但是本专利技术人发现，这种方式不适用于T4 DNA聚合酶的活性测定。因为T4 DNA 聚合酶具有很强的3' -5'外切酶活性，在该测活体系中，3' -5'外切酶活性会在很大程度上 抵消聚合酶活性，造成聚合酶活性难以测定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种非放射性、简便、快速的外切酶活性测定方法，其原理 如图2所示。 具体来说，本专利技术采用的是以下技术方案： 一种T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在无 dNTP存 在的情况下，在以双链线性DNA模板为底物的反应体系中加入T4 DNA聚合酶，反应完成后 检测双链DNA的相对量，由此测出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA聚合酶的外切 酶活性与聚合酶活性相关，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。 优选地，双链DNA的相对量是利用荧光染料，例如仅与双链DNA或仅与单链DNA结 合的荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。 更优选，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料，更优选为市售的成熟商 用突光染料，例如picogreen染料。 在一个实施方案中，本专利技术方法中所采用的双链线性DNA模板是以λ DNA为底物， 在正向和反向引物的存在下通过PCR扩增获得的线性双链DNA，以便建立一种标准的测量 方法。 在一个进一步的实施方案中，所用正向引物为5' -aataacgtcggcaactttgg-3'，反 向引物为 5' -gttacgccaccagtcatcct-3'。 本专利技术的优点： 1. 无放射性污染； 2. 操作步骤简单快速，无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱步骤；可实现高通量、自动化的 活性测定。 3.建立了 T4 DNA聚合酶的外切酶活性和聚合酶活性的定量关系，通过方便的测 定外切酶活性，克服了外切酶活性对聚合酶活性测定的干扰，测量结果更准确。 【附图说明】 图1是现有技术中测定DNA聚合酶活性的技术原理图。 图2是本专利技术的测定T4 DNA聚合酶活性的技术原理图。 图3是现有技术的荧光法测定大肠杆菌pol I和T4 DNA聚合酶获得的荧光酶活 曲线图。 图4是利用本专利技术的方法测定T4 DNA聚合酶获得的荧光酶活曲线图。 图5是不同来源的T4 DNA聚合酶的荧光酶活曲线图。 【具体实施方式】 在dNTP缺失的情况下，T4 DNA聚合酶失去聚合活性，但保留强的3' -5'外切酶活 性，可从双链DNA的两个3'末端向内进行降解，表现出单纯的核酸外切酶的活性。因为T4 DNA聚合酶的聚合酶活性和外切酶活性分属不同结构域，（MICHELLE et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90，ρρ· 2579-2583，April 1993)，本专利技术人假设，其聚合酶活性和 外切酶活性的比例是一个恒定的值，可以通过测定其外切酶活性来推算出其聚合酶活性。 本专利技术首先建立了一种非放射性、简便、快速的外切酶活性测定方法，其原理如图2所示。 如图所示，在无 dNTP存在的情况下，T4 DNA聚合酶可以从双链DNA的3'端开始 降解，从而降低双链DNA的量。通过双链特异性的picogreen染料就可以测定T4 DNA聚合 酶的外切酶活性。 本专利技术人进一步证明了上述假设，从而建立了非放射性、简便、快速的T4 DNA聚合 酶测定方法。 下面将结合具体实施例来具体说明本专利技术。 实施例1.荧光法测定T4 DNA聚合酶的聚合酶活性 M13模板/引物复合物的制备： M13 单链 DNA :M13mpl8 单链 DNA (NEB); 引物：M13 引物 5，-aagccatccgcaaaaatgacctct-3，； M13模板/引物复合物：将M13mpl8单链DNA同M13引物按摩尔比1:1混合，在退火缓 冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM NaCl)中，70°C加热5分钟后，缓慢降至室温，使模 板引物退火。 2.聚合酶反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在无dNTP存在的情况下，在以双链线性DNA模板为底物的反应体系中加入T4 DNA聚合酶，反应完成后检测双链DNA的相对量，由此测出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA聚合酶的外切酶活性与聚合酶活性相关，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。

【技术特征摘要】
1. 一种T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在无dNTP 存在的情况下，在以双链线性DNA模板为底物的反应体系中加入T4 DNA聚合酶，反应完成 后检测双链DNA的相对量，由此测出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA聚合酶的外 切酶活性与聚合酶活性相关，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。2. 如权利要求1所述的T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，双链DNA的相对量 是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。3. 如权利要求2所述的T4 DNA聚合酶活性测定方...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓昱，刘来花，王静，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32