本发明专利技术公开了一种测定烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的方法及其试剂盒。该方法包括以下步骤：（１）建立Ｎａｍｐｔ酶催化底物烟酰胺（ＮＡＭ）转化成产物烟酰胺单核苷酸（ＮＭＮ）的反应；（２）加热法终止酶反应；（３）加入苯乙酮和强碱充分反应；（４）再加入甲酸充分反应；和（５）检测激发波长３２６～４２６ｎｍ，发射波长４１０～５２０ｎｍ处的荧光强度。本发明专利技术还提供一种Ｎａｍｐｔ酶抑制剂或激活剂的高通量筛选方法及其筛选系统。该筛选方法包括在微孔板中将候选化合物和除底物ＮＡＭ以外的Ｎａｍｐｔ酶反应体系孵育；然后按前述步骤测定Ｎａｍｐｔ酶活力。本发明专利技术方法操作简单，反应条件温和，可实现高通量操作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于化学领域，特别涉及一种测定Nampt酶活性的方法及其试剂盒。本发 明还提供一种Nampt酶抑制剂或激活剂的高通量筛选方法及其筛选系统。
技术介绍
烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt，又名内脏脂肪素visfatin或前B细胞克隆增强 因子PBEF)是哺乳动物生命活动中不可或缺的蛋白。Nampt缺陷的纯合子小鼠(Nampt-/-) 死于胚胎发育早期。它调控哺乳动物细胞内必需的能量物质NAD辅酶的水平，具有促血管 生长、抗细胞凋亡、参与机体炎症应答、促进多种细胞分化成熟、潜在的激活祖细胞等生理 功能，对于癌症、脑卒中等疾病防治具有潜在的作用。肿瘤细胞具有很高的NAD消耗和代 谢速率，NAD合成途径的限速酶Nampt是癌症防治的靶标，其酶抑制剂Π(866 (Hasmann Μ, et al.，Cancer Research 2003 ；63 :7436_7442·)禾口 CHS-828(HjarnaaPJV，et al.，Cancer Research 1999;59:5751-5757.)目前都已进入癌症治疗的临床前研究。另一方面，NAD具 有神经保护作用(Liu D，et al. ,Neuromolecular Medicine 2009 ；11 28-42)，且 Nampt 可 防治脑卒中引起的脑损伤(Zhang ff,et al. ,J Cereb Blood Flow Metab. 20IOMay 19. Epub ahead of print)，可作为脑卒中防治的新靶标，上调Nampt酶活性将有利于应对脑卒中发 生发展的多种病理因素，因此Nampt激活剂可能成为有效防治脑卒中的新药。癌症、脑卒中是威胁人类健康和生命的两大重要疾病，也是全球生命科学和医学 领域关注的焦点，因此发现调节Nampt酶活性的小分子将对这些重大疾病的防治具有重要 的意义。高通量筛选是新药研发的重要手段之一，分子水平的筛选体系有助于提高筛选速 度、增加筛选通量、降低筛选成本。然而目前还没有以Nampt为靶标的筛选体系报道；Nampt 酶活性抑制剂仅报道了 3个，FK866, CHS-828以及基于FK866结构改造的分子IS001 (Kang GB, et al.，Molecules and Cells 2009 ；27 :667_671·)；而 Nampt 酶激活剂至今尚无一例 报道。目前已报道的Nampt酶活性测定方法主要有三种使用放射性底物以得到放射性 标记的产物；用HPLC分离反应产物；将产物NMN经Nmnat酶转化为NAD，再被乙醇脱氢酶转 化为荧光产物NADH。这些方法或者操作不安全，或者步骤繁琐，或者成本较高，均不适合通量化操作。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对现有的测定Nampt酶活性的方法不能实 现高通量操作的缺陷，提供一种测定Nampt酶活性的方法及其试剂盒，该方法操作简单，可 实现高通量操作。本专利技术还提供一种Nampt酶抑制剂或激活剂的高通量筛选方法及其筛选 系统。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种测定烟酰胺磷酸核糖转 移酶活性的方法，包括以下步骤(1)建立Nampt酶催化底物烟酰胺(NAM)转化成产物烟酰胺单核苷酸(NMN)的反 应；(2)加热法终止酶反应；(3)加入苯乙酮和强碱充分反应；(4)再加入甲酸充分反应；和(5)检测激发波长326 426nm，发射波长410 520nm处的荧光强度。其中，步骤(1)中，所述的反应的反应体系可以是常规的适用于Nampt酶催化 NAM转化成NMN的反应体系，较佳的包括烟酰胺磷酸核糖转移酶、底物NAM、ATP、PRPP, 缓冲液、MgCl2, BSA、DTT和DMSO0其中，Nampt酶反应浓度较佳的是1 8μ g/ml，更佳 的是2 μ g/ml。底物NAM反应浓度较佳的是0. 2 2 μ M，更佳的是0. 2 μ M。DMSO浓度较 佳的是1 8%，更佳的是2%。所述的反应的反应体系更佳的包括以下各浓度的组分 50mMTris-HCl(pH7. 5),0. 02 % BSA、12mM MgCl2,2mM ΑΤΡ、0· 4mM PRPP、2mMDTT、2μ g/ml Nampt、0. 2 μ M NAM、和2% DMSO。所述的反应的反应条件是常规的Nampt酶的反应条件。 Nampt酶的最佳反应温度是37°C。酶反应时间较佳的是10 60分钟，更佳的是10 30 分钟，最佳的是15分钟。步骤(2)中，所述的加热法是常规的终止酶反应的方法，加热使酶变性而失去活 性，从而酶反应终止。较佳的是95°C加热1分钟。步骤(3)中，所述的反应的反应温度较佳的是0 25°C，更佳的是0°C，反应时间 较佳的是5 30分钟，更佳的是5 10分钟。苯乙酮和强碱的反应浓度较佳的分别为 0. 222M、2. 2%。本专利技术中，所述的强碱较佳的是NaOH或Κ0Η，更佳的是Κ0Η。步骤(4)中，所述的反应较佳的为70 90°C反应5 15分钟，更佳的是70°C反 应5分钟。步骤(5)中，所述荧光强度的检测方法是现有技术。较佳的使用酶标仪进行检 测。荧光检测的波长范围激发波长326 426nm，发射波长410 520nm，最佳激发波长为 382nm，最佳发射波长为445nm。本专利技术也提供一种测定烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的试剂盒，包括烟酰胺磷 酸核糖转移酶(Nampt)和反应底物，所述的反应底物是NAM(烟酰胺)和PRPP(5_磷酸核 糖-ι-焦磷酸)，还包括苯乙酮、强碱和甲酸。本专利技术中，所述的试剂盒较佳的还进一步包括反应缓冲液。所述的反应缓冲液是 常规的用于进行Nampt酶催化底物烟酰胺(NAM)和PRPP生成产物烟酰胺单核苷酸(NMN) 的缓冲液。较佳的是包括以下组分溶液的浓缩液50mM Tris-HCl (pH7. 5)、0. 02%BSAU2mM MgCl2,2mM ATP、2mM DTT和2% DMSO。上述浓度的溶液中各组分的是较佳的工作浓度，而所 述浓缩液中各组分的浓度是其倍数，该浓缩倍数可以是常规，较佳的是10倍。DMSO浓度较 佳的是1 8%，更佳的是2%。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之二是一种烟酰胺磷酸核糖转移酶 抑制剂或激活剂的高通量筛选方法，包括以下步骤①在微孔板中加入候选化合物和除底物NAM以外的烟酰胺磷酸核糖转移酶反应 体系，孵育；②加入底物NAM启动反应；5③加热法终止酶反应；④加入苯乙酮和强碱充分反应；⑤再加入甲酸充分反应；和⑥检测激发波长326 426nm，发射波长410 520nm处的荧光强度。步骤①中，所述的微孔板可以是常规的实验耗材，如48孔板、96孔板，384孔板等。 所述孵育是为了保证候选化合物与酶的充分结合，较佳的是在37°C孵育0-30分钟，更佳的 是37 °C预孵育5min。步骤②中，所述的反应的反应体系如上文所述，可以是常规的适用于Nampt酶催 化NAM转化成NMN的反应体系，较佳的包括烟酰胺磷酸核糖转移酶、底物NAM、ATP、PRPP、 缓冲液、MgCl2、BSA、DTT和DMSO。Nampt酶反应浓度较佳的是1 8 μ g/ml，更佳的是2 μ g/ ml。底物NAM反应浓本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤： （１）建立Ｎａｍｐｔ酶催化底物烟酰胺（ＮＡＭ）转化成产物烟酰胺单核苷酸（ＮＭＮ）的反应； （２）加热法终止酶反应； （３）加入苯乙酮和强碱充分反应； （４）再加入甲酸充分反应；和 （５）检测激发波长３２６～４２６ｎｍ，发射波长４１０～５２０ｎｍ处的荧光强度。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：缪朝玉，张偌瑜，管云枫，王培，徐添颖，徐学文，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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