本发明专利技术提出了一种受农药侵害烟叶的超氧化物歧化酶活性的测定方法，包括以下步骤：(1)试剂配制，包括配制：磷酸缓冲液、提取介质、甲硫氨酸溶液、NBT、EDTA‑Na2、核黄素溶液；(2)从烟叶中制备酶液(3)测定样品超氧化物歧化酶的活性；(4)在烟草5～6片真叶期移入二氯喹啉酸添加浓度为1.04×10‑3mg/kg、2.08×10‑3mg/kg、4.17×10‑3mg/kg、8.33×10‑3mg/kg、1.67×10‑2mg/kg药土中，分别在7d、14d、21d、28d、35d采用步骤(1)～(3)测量烟叶超氧化物歧化酶活性。解决了现有技术中对受氯喹啉酸侵害的烟叶中，SOD受到的影响与变化了解较少，测定不够精准的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及化学检测分析领域，特别是指受农药侵害烟叶的超氧化物歧化酶活性的测定方法。
技术介绍
二氯喹啉酸是防除稻田稗草的特效选择性除草剂，属激素型喹啉羧酸类除草剂，杂草中毒症状与生长素类作用相似，主要用于防治稗草且适用期很长，1-7叶期均有效。水稻安全性好。有关研究表明二氯喹啉酸作为激素类除草剂，能够刺激乙烯在植物体内积累。二氯喹啉酸的靶标位点位于细胞壁的生物合成中，在禾本科植物中起到细胞壁合成抑制剂的作用，不同禾本科植物作用位点对二氯喹啉酸的敏感性。乙烯可抑制细胞壁合成酶的活性从而减少细胞壁的合成，乙烯含量的提高引起了ABA的积累，ABA在调节植物生长、叶片衰老、气孔开放起重要的作用。二氯喹啉酸在土壤中有积累作用，对烟草生产会产生明显的药害。我国部分烟田曾因氯喹啉酸出现大面积烟草畸形生长现象，症状为新叶先出现不正常生长,叶缘下卷，叶片向背皱缩,致使叶片狭长，严重者呈线状，严重影响烟草的产量和质量。由于烟草这一作物的特殊性，对于其受到氯喹啉酸的影响将直接影响烟农的收成，以及烟叶的质量，因此，对于氯喹啉酸对烟草的影响，需要进行多方面的，准确的，可靠的分析，目前，对于农药侵害植物的分析虽然有报道以及一般性的分析方法，但针对氯喹啉酸对烟草侵害的研究分析还相对较少，超氧化物歧化酶(SOD)作为重要的还原剂，在细胞中具有极其重要的作用，但目前对于受农药(氯喹啉酸)侵害的烟叶中，SOD受到的影响与变化，缺少细致深入的研究，造成在氯喹啉酸对烟草的侵害的程度，影响等少有深入的了解，并的分析的结果上还存在较大的准确度差异。
技术实现思路
本专利技术提出一种受农药侵害烟叶的超氧化物歧化酶活性的测定方法，解决了现有技术中对受农药(氯喹啉酸)侵害的烟叶中，SOD受到的影响与变化了解较少，测定不够精准的问题。本专利技术的技术方案是这样实现的：受农药侵害烟叶的超氧化物歧化酶活性的测定方法，包括以下步骤：(1)试剂配制，包括配制：磷酸缓冲液、提取介质、甲硫氨酸溶液、NBT、EDTA-Na2、核黄素溶液；(2)从烟叶中制备酶液(3)测定样品超氧化物歧化酶的活性：以遮光的对照管作为空白，分别在560nm波长下测定步骤(2)中制备的酶液的吸光度，按下式计算超氧化物歧化酶活性。式中：SOD总活性以每克鲜重酶单位表示：A0——照光对照管的光吸收值；As——样品管的光吸收值；V1——样液总体积(mL)；VT——测定时样品用量(mL)；W——样品鲜重(g)。(4)在烟草5～6片真叶期移入二氯喹啉酸添加浓度为1.04×10-3mg/kg、2.08×10-3mg/kg、4.17×10-3mg/kg、8.33×10-3mg/kg、1.67×10-2mg/kg药土中，分别在7d、14d、21d、28d、35d采用步骤(1)～(3)测量烟叶超氧化物歧化酶活性。进一步，步骤(1)中，试剂的配制采用以下配比和参数：0.05mol·L-1磷酸缓冲液；提取介质：50mmol·L-1pH7.8磷酸缓冲液，内含1％聚乙烯吡咯烷酮；130mmol·L-1甲硫氨酸溶液：称1.399gMet，用磷酸缓冲液溶解并定容至100mL；750μmol·L-1NBT：称取0.06133gNBT，用磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，避光保存；100μmol·L-1EDTA-Na2：称取0.037224gEDTA-Na2，定容1000mL；20μmol·L-1核黄素溶液：称取0.0075g核黄素，定容至100mL，避光保存。进一步，步骤(2)中，包括以下步骤：取第四片展开烟草叶片，去中脉，准确称取0.3g于预冷的研钵中，加入预冷的提取介质1.5mL，在冰浴中研磨成匀浆，转移至1.5mL离心管中，-4℃13000rpm下冷冻离心20min，上清夜即为SOD粗提液；显色反应：取透明度好、质地相同的试管，样品测定管和对照；混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx紫外灯下反应5min。本专利技术的所述受农药侵害烟叶的超氧化物歧化酶活性的测定方法，针对烟草的特性，结合对氯喹啉酸的侵害机理研究，对农药侵害过程中SOD活性的变化，试剂的选配，操作环境、参数等进行了较为严格的调整与控制，使得到的氯喹啉酸侵害烟叶的SOD的活性的测量更加准确，可靠，为合理使用氯喹啉酸以及消除影响，提供科学的依据。附图说明图1为二氯喹啉酸对烟草叶片SOD活性的动态分析。具体实施方式下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例烟草种子采用品种为K326。温室播种，育苗，于五至六片真叶期移栽，进行农药侵害烟叶的SOD活性的测定(1)试剂配制0.05mol·L-1磷酸缓冲液(pH7.8)；提取介质：50mmol·L-1pH7.8磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)；130mmol·L-1甲硫氨酸(Met)溶液：称1.399gMet，用磷酸缓冲液溶解并定容至100mL；750μmol·L-1NBT：称取0.06133gNBT，用磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，避光保存；100μmol·L-1EDTA-Na2：称取0.037224gEDTA-Na2，定容1000mL；20μmol·L-1核黄素溶液：称取0.0075g核黄素，定容至100mL，避光保存(2)酶液的制备取第四片展开烟草叶片，去中脉，准确称取0.3g(共三份)于预冷的研钵中，加入预冷的提取介质1.5mL(分三次加入，一次研磨，两次冲洗)，在冰浴中研磨成匀浆，转移至1.5mL离心管中，-4℃13000rpm下冷冻离心20min，上清夜即为SOD粗提液。表1显色反应试剂配置显色反应：取透明度好、质地相同的试管，样品测定管和对照(一支遮光，2支照光)，按表1加入试剂。混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx紫外灯下反应5min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，视酶活性高低适当调整反应时间)。(3)样品超氧化物歧化酶活性的测定至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。以遮光的对照管作为空白，分别在560nm波长下测定各管的吸光度，按下式计算超氧化物歧化酶(SOD)活性。式中：SOD总活性以每克鲜重酶单位表示：A0——照光对照管的光吸收值；As——样品管的光吸收值；V1——样液总体积(mL)；VT——测定时样品用量(mL)；W——样品鲜重(g)。(4)在烟草5～6片真叶期移入二氯喹啉酸添加浓度为1.04×10-3mg/kg、2.08×10-3mg/kg、4.17×10-3mg/kg、8.33×10-3mg/kg、1.67×10-2mg/kg药土中，分别在7d、14d、21d、28d、35d采用步骤(1)～(3)测量烟叶超氧化物歧化酶活性。测定结果如图1所示，可以看出，二氯喹啉酸对烟草POD酶活力的影响是随施用量增加而增强。移植后28d，不同施药量处理较对照酶活力增强。对照烟草叶片中过氧化物酶活力为17.47OD·g-1·min-1，二氯本文档来自技高网...
【技术保护点】
受农药侵害烟叶的超氧化物歧化酶活性的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)试剂配制，包括配制：磷酸缓冲液、提取介质、甲硫氨酸溶液、NBT、EDTA‑Na2、核黄素溶液；(2)从烟叶中制备酶液(3)测定样品超氧化物歧化酶的活性：以遮光的对照管作为空白，分别在560nm波长下测定步骤(2)中制备的酶液的吸光度，按下式计算超氧化物歧化酶活性。式中：SOD总活性以每克鲜重酶单位表示A0——照光对照管的光吸收值；As——样品管的光吸收值；V1——样液总体积(mL)；VT——测定时样品用量(mL)；W——样品鲜重(g)；(4)在烟草5～6片真叶期移入二氯喹啉酸添加浓度为1.04×10‑3mg/kg、2.08×10‑3mg/kg、4.17×10‑3mg/kg、8.33×10‑3mg/kg、1.67×10‑2mg/kg药土中，分别在7d、14d、21d、28d、35d采用步骤(1)～(3)测量烟叶超氧化物歧化酶活性。
【技术特征摘要】
1.受农药侵害烟叶的超氧化物歧化酶活性的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)试剂配制，包括配制：磷酸缓冲液、提取介质、甲硫氨酸溶液、NBT、EDTA-Na2、核黄素溶液；(2)从烟叶中制备酶液(3)测定样品超氧化物歧化酶的活性：以遮光的对照管作为空白，分别在560nm波长下测定步骤(2)中制备的酶液的吸光度，按下式计算超氧化物歧化酶活性。式中：SOD总活性以每克鲜重酶单位表示A0——照光对照管的光吸收值；As——样品管的光吸收值；V1——样液总体积(mL)；VT——测定时样品用量(mL)；W——样品鲜重(g)；(4)在烟草5～6片真叶期移入二氯喹啉酸添加浓度为1.04×10-3mg/kg、2.08×10-3mg/kg、4.17×10-3mg/kg、8.33×10-3mg/kg、1.67×10-2mg/kg药土中，分别在7d、14d、21d、28d、35d采用步骤(1)～(3)测量烟叶超氧化物歧化酶活性。2.如权利要求1中所述受农药侵害烟叶的超氧化物歧化酶活性的测定方法，其特征在于：步骤(1)中，试剂的配制采用以下配比和参数：0.05...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽鹏，
申请(专利权)人：中国烟草总公司广东省公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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