一种枣树超氧化物歧化酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体为一种枣树超氧化物歧化酶基因及其应用，该基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列，核苷酸序列编码的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。本发明专利技术首次从枣树中分离出枣树超氧化物歧化酶基因ZjSOD，构建植物表达载体，获得转基因拟南芥植株，该基因作为目的基因导入植物，对于植物品种改良具有重要的现实意义，对于具有优良抗性的植物的抗逆机制的深入研究，有助于明确逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，为进一步充分利用这些优良抗性基因来提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础，同时有助于了解SOD在植物活性氧信号转导中的作用，促进人们对活性氧作为信号分子的了解。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体为一种枣树超氧化物歧化酶基因及其应用。
技术介绍
植物在逆境条件下会产生大量活性氧类（如H2O2、OH—、O2—）引起蛋白变性、DNA突变和膜脂氧化等而危及正常的生理活动。植物为了将活性氧的损伤效应降至最低，已进化形成了一系列的酶学及非酶学机制清除活性氧。超氧化物歧化酶（SODs，EC1.15.1.1.）是一类广泛存在于植物体内的金属酶，能专一地清除生物氧化中的超氧阴离子自由基，将其发生歧化反应生成O2和H2O2。根据酶活性位点的金属辅因子，SOD可以分为三类：Cu/ZnSOD、FeSOD和Mn-SOD，Cu/ZnSOD蛋白主要存在于细胞质或叶绿体中、MnSOD蛋白存在于线粒体、FeSOD蛋白存在于叶绿体中。人们已利用基因工程的方式将外源SOD基因转入特定的植物体内来研究其作用机制和生理功能。Cannon 等在1987年首次从玉米中克隆得到超氧化物歧化酶基因，随后在番茄、烟草、水稻、拟南芥、桃子、木薯、小麦、苜蓿、甘蔗等植物中克隆获得SOD基因，研究成果为：低温胁迫条件下的超表达SOD 基因的苜蓿生长状况明显优于野生型；SOD转基因玉米植株抗氧化胁迫的能力明显增强；Que 等克隆得到甘蔗Mn-SOD 的全长序列，并发现黑穗病菌处理可显著诱导其表达；烟草Cu/Zn-SOD 在NaCl 胁迫下呈现上调表达；木薯Cu/Zn-SOD 在外源胁迫条件下（如NaCl、ABA、乙烯和蔗糖）的表达量均显著增加；在盐胁迫条件下，超表达小麦Cu/Zn-SOD 的转基因烟草能明显缓解NaCl 对植株的伤害作用；干旱胁迫下草地早熟禾叶片中的胞质和叶绿体Cu/Zn-SOD 表达量下调；而在百脉根叶片中的胞质和叶绿体Cu/Zn-SOD 的表达水平在NaCl 胁迫下均上调；外源ABA 胁迫抑制东方山羊草Cu/Zn-SOD的表达，而PEG和NaCl胁迫诱导该基因的表达。植物中SODs的结构、对底物的特异性及在植物组织的分布上都不相同，它们对抵御外界胁迫起了很重要的作用，但我们对其功能及结构特性的认识仍很有限，还需要做大量的工作。因此，克隆和鉴定植物中SODs，研究抗逆机制以及与逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，可为充分利用这些优良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础。到目前为止，未见有从枣树中分离出枣树超氧化物歧化酶基因用于植物品种改良上的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种枣树超氧化物歧化酶基因及其应用。本专利技术是采用如下技术方案实现的：一种枣树超氧化物歧化酶基因，该基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。该基因的核苷酸序列开放阅读框编码的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。该枣树超氧化物歧化酶基因是以壶瓶枣结果枝cDNA为模板，由下述引物对为引物扩增得到的：上游引物P1的序列为：5'—acgaattcagatggcaatgggaagtg—3'，下游引物P2的序列为：5'—atcccgggtagcagactctctctcata—3'。上述枣树超氧化物歧化酶基因在提高植物抗逆性中的应用。本专利技术从山西省农业科学院生物技术研究中心园艺作物生物技术研究室构建壶瓶枣（Ziziphus jujuba Mill hupingzao）结果枝（即枣吊）cDNA文库中筛选到枣树超氧化物歧化酶基因的全序列，将其命名为ZjSOD（Ziziphus jujuba superoxide dismutases）。生物信息学分析表明ZjSOD基因cDNA序列全长为699 bp，编码232个氨基酸，其中包含有22个酸性氨基酸，24个碱性氨基酸，计算得知蛋白质的相对分子量为25.5971 KD，理论等电点为8.59。根据枣树超氧化物歧化酶基因cDNA编码的序列，设计带有EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位点的特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其上游引物为P1的序列为：5'—acgaattcagatggcaatgggaagtg—3'， 包含EcoRⅠ限制性酶切位点（即有下划线部分）；下游引物为P2的序列为：5'—atcccgggtagcagactctctctcata—3'，包含该SmaⅠ限制性酶切位点（即下划线部分）。经限制性内切酶EcoRⅠ和SmaⅠ修饰后连接于携带有黄色荧光蛋白基因YFP的植物表达载体PEZR(K)-LNY上，然后再经含卡纳霉素的LB平板筛选转化子、PCR鉴定、酶切鉴定、测序证明植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjSOD构建成功。通过冻融法将携带目的基因的植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjSOD转入农杆菌LBA4404的感受态细胞中，经含卡纳霉素的LB平板筛选转化子、PCR鉴定、酶切鉴定、测序证明工程菌PEZR(K)-LNY-ZjSOD构建成功。农杆菌介导ZjSOD基因通过浸花法转化拟南芥，经含卡那霉素Km的MS培养基筛选获得含有目的基因ZjSOD的转基因拟南芥植株T0代，经PCR鉴定目的基因证实ZjSOD成功转入拟南芥。为了进一步研究枣树超氧化物歧化酶基因在非生物胁迫（高盐、渗透）条件下的表达分析，用不同浓度的NaCl处理野生型枣幼苗，提取RNA，逆转录为cDNA后，对ZjSOD基因进行表达分析，结果显示：与未用NaCl处理的对照相比，ZjSOD基因受盐胁迫的诱导，同时分别用不同浓度的PEG6000处理野生型枣幼苗，提取RNA，逆转录为cDNA后，对ZjSOD基因进行表达分析，结果显示：与未用PEG处理的对照相比，ZjSOD基因受PEG6000（模拟干旱条件）的诱导，以上两个实验表明ZjSOD基因在转录水平受盐和干旱诱导。为了进一步研究枣树超氧化物歧化酶基因在植物生长发育中的功能，本专利技术构建了ZjSOD基因的过量表达载体，转化拟南芥，对获得的转基因阳性株系进行表型分析与功能研究，主要研究内容包括 ZjSOD基因在种子萌发时期参与盐、PEG和ABA胁迫应答试验，结果表明ZjSOD增强了转基因种子对盐、PEG的敏感性，同时增强了对H2O2的耐受性；在幼苗发育时期参与盐、PEG和ABA胁迫应答试验，结果表明在拟南芥中过量表达ZjSOD增强了植株对盐胁迫和PEG的敏感性，同时增强了对H2O2的耐受性；此外通过ZjSOD转基因拟南芥在盐、PEG和H2O2胁迫条件下生理指标的测定分析，表明ZjSOD基因可能在幼苗发育早期参与盐、渗透胁迫及H2O2的应答；为了研究ZjSOD基因参与干旱、高盐胁迫应答及ROS信号通路的机制，选取参与盐信号通路应答的SOS2基因、参与干旱胁迫RD29A和ERD15及参与ROS信号通路相关基因CAT1、APX1和GPX3进行转录水平上的表达分析，结果表明，ZjSOD基因在ROS信号途径中起正调控作用，而在干旱和高盐胁迫中起负调控作用，同时也暗示ZjSOD基因可能直接参与ROS信号途径，从而间接参与干旱和高盐胁迫应答。与现有技术相比，本专利技术首次从枣树中分离出枣树超氧化物歧化酶基因ZjSOD，该基因作为目的基因导入植物，对于植物品种改良具有重要的现实意义，对于具有优良抗性的植物的抗逆机制的深入研究，有助于明确逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，为进一步充分利用这些优良抗性基因来提高植物的抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枣树超氧化物歧化酶基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种枣树超氧化物歧化酶基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。2.根据权利要求1所述的一种枣树超氧化物歧化酶基因，其特征是该基因的核苷酸序列开放阅读框编码的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。3.根据权利要求1或2所述的一种枣树超氧化物歧化酶基因，其特征是该枣树...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂园军，曹秋芬，李建军，肖蓉，邓舒，董艳辉，薄晓峰，李亚莉，侯丽媛，侯富恩，
申请(专利权)人：山西省农业科学院农业资源与经济研究所，山西省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山西;14