本发明专利技术公开了一种D‑乳酸氧化酶，该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，为可溶性蛋白，辅因子为FAD，其最适温度为55℃，最适pH为8.0，在pH 7.0～9.0范围内具有60％以上的酶活；该酶能够以分子氧为直接电子受体催化D‑乳酸氧化生成丙酮酸和过氧化氢，当D‑乳酸浓度在0.1～1.3mmol/L范围内时，该酶催化生成的过氧化氢浓度与初始D‑乳酸浓度呈线性相关；该酶对D‑乳酸的表观Km和Vmax分别为3.62±0.53mmol/L和0.52±0.05U/mg，该酶对另一底物O2的表观Km和Vmax分别为0.16±0.01mmol/L和0.97±0.03U/mg。本发明专利技术所述的D‑乳酸氧化酶可用于制备通过测定过氧化氢浓度来检测D‑乳酸的生物传感器，实现D‑乳酸简便、快速的定量检测。
【技术实现步骤摘要】
一种D-乳酸氧化酶及其在D-乳酸检测中的应用
本专利技术涉及一种乳酸氧化酶及其应用，尤其涉及一种新型D-乳酸氧化酶及其在D-乳酸检测中的应用。
技术介绍
乳酸广泛存在于自然界中，如酸奶、糖蜜、葡萄酒、苹果以及动植物体内。乳酸有L-乳酸和D-乳酸两种光学异构体。D-乳酸在人体血液中的异常积累会导致D-乳酸血症，D-乳酸血症必须通过快速测定急性症状发生时的D-乳酸水平进行确诊。另外，D-乳酸是也一种重要的平台化合物，广泛应用于医药、化工、生物合成等领域，因此在工业生产中也经常涉及到D-乳酸的检测。然而，目前快速测定乳酸浓度的乳酸生物传感器仅能够检测L-乳酸，因此迫切需要一种特异性快速检测D-乳酸的方法，如D-乳酸生物传感器。目前被广泛使用的L-乳酸生物传感器通常是基于过氧化氢的安培检测法，即将L-乳酸氧化酶固定在过氧化氢电极上进行L-乳酸检测，直接检测的信号是过氧化氢，过氧化氢是由固定在电极表面的L-乳酸氧化酶催化L-乳酸直接被氧气氧化而生成的。但由于到目前为止尚无能够以分子氧为电子受体催化D-乳酸氧化的D-乳酸氧化酶的报道，一定程度上阻碍了D-乳酸生物传感器的开发，因而目前D-乳酸的检测通常使用D-乳酸检测试剂盒或液相色谱分析，但与利用L-乳酸生物传感器检测L-乳酸相比，这两种D-乳酸检测方法仍存在检测费用较高、检测过程复杂、耗时相对较长等不足。目前已有文献报道了几种基于D-乳酸脱氢酶的D-乳酸生物传感器，例如Montagné等利用NAD-依赖型的D-乳酸脱氢酶结合NADH氧化酶和NAD+的方法制备的D-乳酸生物传感器(Montagnéetal.,1995,Anal.Chim.Acta.,315:297-302)，Pohanka等利用来源于酵母的细胞色素c依赖型的D-乳酸脱氢酶结合添加人工电子受体吩嗪硫酸甲酯(PMS)的方法制备的D-乳酸生物传感器(Pohankaetal.,2008,FoodTechnol.Biotechnol.46:107–110)，山东省科学院生物研究所利用从美国sigma公司购买的来源于菠菜的乙醇酸脱氢酶(EC1.1.1.26)制备的D-乳酸生物传感器(专利公开号：CN101349668A)。但检索发现目前尚无利用以分子氧为直接电子受体催化D-乳酸氧化的D-乳酸氧化酶及利用其制备的D-乳酸生物传感器的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术中D-乳酸检测手段的不足，本专利技术要解决的技术问题是提供一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶能够以分子氧为直接电子受体氧化D-乳酸生成丙酮酸和过氧化氢；以及该酶在D-乳酸检测中的应用。本专利技术所述的新型D-乳酸氧化酶，其特征在于，所述D-乳酸氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；该酶为可溶性蛋白，辅因子为FAD，其最适温度为55℃，最适pH为8.0，在pH7.0～9.0范围内具有60％以上的酶活；该酶能够以分子氧为直接电子受体催化D-乳酸氧化生成丙酮酸和过氧化氢，当D-乳酸浓度在0.1～1.3mmol/L范围内时，该酶催化生成的过氧化氢浓度与初始D-乳酸浓度呈线性相关；该酶对D-乳酸的表观Km和Vmax分别为3.62±0.53mmol/L和0.52±0.05U/mg，该酶对另一底物O2的表观Km和Vmax分别为0.16±0.01mmol/L和0.97±0.03U/mg。编码上述D-乳酸氧化酶的基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，该基因来源于氧化葡萄糖酸杆菌621H，NCBI数据库中该基因的基因座标签(Locus_tag)为GOX2071。进一步的，上述的D-乳酸氧化酶基因还包括能够编码具有与来源于氧化葡萄糖酸杆菌621H的D-乳酸氧化酶相同功能蛋白的SEQIDNO.1序列的变异形式。这些变异形式包括：若干个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’末端添加若干个核苷酸。上述D-乳酸氧化酶以如下方法制得：(1)将来源于氧化葡萄糖酸杆菌621H的D-乳酸氧化酶基因(核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)克隆到大肠杆菌表达载体pET25b中，转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)，氨苄青霉素抗性筛选获得含有D-乳酸氧化酶基因重组质粒的重组菌株；(2)将上述重组菌株接种于LB液体培养基中，当OD600nm达到0.4～0.8后加入终浓度1mmol/L的IPTG诱导表达，诱导表达时间为6小时，诱导表达温度为37℃；(3)利用Souce30Q阴离子交换柱进行D-乳酸氧化酶的初步纯化，利用洗脱缓冲液梯度洗脱，收集含有D-乳酸氧化酶的洗脱液；(4)将上述含有D-乳酸氧化酶的洗脱液，进一步利用HisTrapNi亲和层析柱纯化，获得D-乳酸氧化酶电泳纯的纯酶。本专利技术所述的D-乳酸氧化酶在制备通过测定过氧化氢浓度来检测D-乳酸的生物传感器中的应用。本专利技术所述的新型D-乳酸氧化酶与广泛报道的L-乳酸氧化酶的催化特性相似，但催化的底物构型完全相反。本专利技术所述的D-乳酸氧化酶能够以分子氧为直接电子受体氧化D-乳酸生成丙酮酸和过氧化氢，生成的过氧化氢可用作D-乳酸生物传感器过氧化氢电极的直接检测信号；该酶为可溶性蛋白，纯化和保存过程无需添加表面活性剂，因此更易于固定于生物传感器的电极表面；最适pH8.0，在pH7.0～9.0范围内仍具有60％以上的酶活，且在pH7.0～9.0范围内稳定性非常好，这一可应用的pH宽度也涵盖了正常人体血液中的pH范围(7.35～7.45)；该酶最适温度为55℃，在50℃以下稳定性较好，具有较好的应用潜力。使用Clark-型液相氧电极(Oxytherm,Hansatech，英国)测定本专利技术所述的D-乳酸氧化酶的表观动力学参数，结果如下，该酶对D-乳酸的表观Km和Vmax分别为3.62±0.53mmol/L和0.52±0.05U/mg，该酶对另一底物O2的表观Km和Vmax分别为0.16±0.01mmol/L和0.97±0.03U/mg。在一定浓度本专利技术所述的D-乳酸氧化酶(0.35U/mL)催化下，D-乳酸浓度在一定范围内(如0.1～1.3mmol/L)时，初始反应液中的D-乳酸浓度与生成的过氧化氢浓度呈线性相关，因此非常有望通过将该酶固定到能够直接检测过氧化氢浓度的过氧化氢电极表面，以制备新型的D-乳酸生物传感器，从而实现D-乳酸的廉价、简便、快速的定量检测。综上，本专利技术具有的突出特点是：(1)本专利技术首次提供了一种能够以分子氧为直接电子受体氧化D-乳酸的D-乳酸氧化酶，该酶氧化D-乳酸生成的过氧化氢可用作D-乳酸生物传感器过氧化氢电极的直接检测信号。(2)本专利技术所提供的D-乳酸氧化酶为可溶性蛋白，易于固定到生物传感器的电极表面。(3)本专利技术所提供的D-乳酸氧化酶具有较好的pH稳定性和热稳定性、具有良好的线性检测范围。(4)本专利技术为制备具有广泛应用前景的D-乳酸生物传感器提供了新的有效酶源，在制备D-乳酸生物传感器及D-乳酸的检测领域具有应用价值。附图说明图1为重组D-乳酸氧化酶的SDS-PAGE图谱。其中，泳道M为标准分子量蛋白，泳道1为包含空质粒pET25b的E.coliBL21(DE3)对照菌株粗酶液，泳道2为包含重组质粒pET25b-GOX2071的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株诱导表达后的粗酶液，泳道3为重组D-乳酸氧化酶阴本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种D‑乳酸氧化酶，其特征在于，所述D‑乳酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；该酶为可溶性蛋白，辅因子为FAD，其最适温度为55℃，最适pH为8.0，在pH 7.0～9.0范围内具有60％以上的酶活；该酶能够以分子氧为直接电子受体催化D‑乳酸氧化生成丙酮酸和过氧化氢，当D‑乳酸浓度在0.1～1.3mmol/L范围内时，该酶催化生成的过氧化氢浓度与初始D‑乳酸浓度呈线性相关；该酶对D‑乳酸的表观Km和Vmax分别为3.62±0.53mmol/L和0.52±0.05U/mg，该酶对另一底物O2的表观Km和Vmax分别为0.16±0.01mmol/L和0.97±0.03U/mg。
【技术特征摘要】
1.一种D-乳酸氧化酶在制备检测D-乳酸的生物传感器中的应用；其中，所述D-乳酸氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；该酶为可溶性蛋白，辅因子为FAD，其最适温度为55℃，最适pH为8.0，在pH7.0～9.0范围内具有60％以上的酶活；该酶能够以分子氧为直接电子受体催化D-乳酸氧化生成丙酮酸和过氧化氢，...
【专利技术属性】
技术研发人员：高超，盛彬彬，马翠卿，许平，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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