本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体为一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶SOD、制备方法及其应用。本发明专利技术中的超氧化物歧化酶SOD的氨基酸序列如SEQ ID NO:4～6所示。将本发明专利技术中的超氧化物歧化酶SOD添加到护肤品中，可使得护肤品在多种极端条件下亦都能发挥其效能，使清除超氧离子自由基的效率增高2.5倍，尤其是增强了高温、高盐、偏酸性环境下清除超氧离子自由基的能力。因此在夏季防晒性产品、沿海地区及易出汗的消费者群体中用广泛应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及超氧化物歧化酶S0D，尤其涉及一种抗极特性超氧化物歧化酶S0D、高 效制备方法及其应用，属于基因工程
技术介绍
机体物质和能量代谢会产生一些有毒的副产物，例如超氧离子自由基（02 )。机体 内〇2形成分为生理性和病理性两方面。正常生理过程的〇2主要来源于呼吸链中电子传递 过程。多种疾病的发病过程中也会产生大量〇 2。过量的〇2如不及时清除，会损伤细胞。机 体存在应对超氧离子自由基的一套机制，主要包括超氧化物歧化酶S0D，它可以将02歧化 为H202和0 2，而过氧化氢酶等可催化过氧化氢分解，最终清除超氧离子自由基。S0D专一1性 清除超氧离子自由基，催化反应：2H++02 -H202+02。按照S0D所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD(二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD(紫红色）和Fe-SOD(黄褐色）三种。S0D对过量超 氧离子自由基的及时清除保证了机体内〇2含量的相对平衡。因S0D具有抗衰老、抗辐射、 抗炎及抗癌等作用，在医药、化妆品及食品工业等方面有广泛应用。 S0D是一种酸性蛋白，具有一定的耐酸、抗热能力。由于护肤品多为中性、高盐、多 种有机分子混合物的形式，因此如何提高护肤品中S0D的有效性成为其应用的关键。
技术实现思路
为了克服现有S0D在耐受极端条件方面的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于 耐受极端条件的超氧化物歧化酶S0D、制备方法及其应用。本专利技术的超氧化物歧化酶S0D 能耐受极端条件，具有耐热、耐盐或耐酸等特性；本专利技术的超氧化物歧化酶SOD应用于护肤 品，可提高护肤品清除超氧离子自由基的效果。 本专利技术的具体技术方案介绍如下。 本专利技术提供一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶S0D，其为敏捷气热菌、沃氏 嗜盐富饶菌、嗜酸热硫化叶菌的超氧化物歧化酶S0D，其氨基酸序列分别如SEQIDN0:4~ 6所示。 本专利技术还提供一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶S0D的制备方法，具体步 骤如下： (1)构建超氧化物歧化酶S0D的重组表达质粒 基于极端微生物编码的超氧化物歧化酶S0D基因序列，设计引物，扩增基因，并将 基因克隆到原核表达载体，构建超氧化物歧化酶S0D重组表达质粒； (2)重组表达超氧化物歧化酶S0D 将构建的超氧化物歧化酶SOD重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21 (DE3)或 Rosetta(DE3)，得到超氧化物歧化酶S0D重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行菌超氧 化物歧化酶S0D诱导表达； (3)亲和纯化表达的超氧化物歧化酶SOD 离心收集诱导表达超氧化物歧化酶SOD后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白 裂解液，超声波破碎菌体，离心收集含有超氧化物歧化酶S0D的大肠杆菌裂解上清液；再利 用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中分别纯化超氧化物歧化酶S0D; (4)检测超氧化物歧化酶SOD的酶活性和抗极特性 将纯化后超氧化物歧化酶S0D进行酶活性和抗极特性检测，从中筛选出耐受极端 条件的的超氧化物歧化酶S0D。活性测定采用邻苯三酚自氧化法，酶活性单位定义为：每毫 升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。 本专利技术中，步骤（1)中，所述极端微生物选自敏捷气热菌（Aeropyrumpernix)、沃 氏嗜盐富饶菌（Haloferaxvolcanii)或嗜酸热硫化叶菌（Sulfololbusacidocaldarius) 中任意一种。 本专利技术中，步骤（1)中，基于极端微生物编码的超氧化物歧化酶S0D基因序列分别 如SEQIDN0:1~3所示。 本专利技术中，步骤（1)中，原核表达载体为pET28质粒。 本专利技术中，步骤（2)中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将超氧化物 歧化酶S0D重组表达菌株培养至0D6M= 0. 4-1. 0,再加入0. 5mM诱导剂IPTG在37°C温度 下培养3小时或22°C温度下培养12小时进行诱导表达。 本专利技术中，步骤（3)中，所述非变性蛋白裂解液的组成如下：20mmol/LpH值为8. 0 的1^8-11(：1，300臟〇1/1恥(：1，0.5臟〇1/101'1'，1(^〇1%甘油。 本专利技术还进一步提供一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶S0D在护肤品中 的应用。 与现有普通S0D相比，本专利技术的S0D能耐极端条件，具有耐热、耐盐、耐酸等显著特 点，具体如下： (1)抗逆性能好，由于极端微生物生存在高温、高盐等极端环境，它们的超氧化物 歧化酶S0D具有相应的抗逆性能，在高温、高盐等极端环境下具有很高的活性，满足护肤品 等行业的特殊需求。 (2)在护肤品应用中，添加1种或多种具有不同抗逆特性的S0D，可以综合应对高 温、高盐、酸碱等特殊环境，大大提高了护肤品中S0D的总效果，使得护肤品在高温、高盐等 情况下具有很强的清除超氧离子自由基的能力，改善护肤效果。【附图说明】 图1是敏捷气热菌超氧化物歧化酶S0D的抗极特性图。 图2是沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶S0D的抗极特性图。 图3是嗜酸热硫化叶菌超氧化物歧化酶S0D的抗极特性图；(A耐酸测试；B耐热测 试）。 图4是敏捷气热菌、沃氏嗜盐富饶菌、嗜酸热硫化叶菌超氧化物歧化酶S0D对护肤 品消除超氧离子自由基的促进作用对比图。【具体实施方式】 以下通过实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本 专利技术的限定。 实施例1敏捷气热菌超氧化物歧化酶S0D的制备 第一步，设计合成敏捷气热菌超氧化物歧化酶S0D基因，并插入pET28表达载体， 构建超氧化物歧化酶S0D的重组表达质粒。重组敏捷气热菌超氧化物歧化酶S0D的N端带 有来源于PET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化。 敏捷气热菌超氧化物歧化酶S0D的基因序列如SEQIDN0 :1所示。 第二步，重组表达敏捷气热菌超氧化物歧化酶S0D。将敏捷气热菌超氧化物歧化酶 S0D重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21 (DE3)，得到敏捷气热菌超氧化物歧化酶S0D 重组表达菌株。将表达菌株培养至〇D6M= 0. 6,加入0. 5mM诱导剂IPTG，在37°C温度下培 养3小时，诱导超氧化物歧化酶S0D表达。[003当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶SOD，其特征在于，其为敏捷气热菌、沃氏嗜盐富饶菌、嗜酸热硫化叶菌的超氧化物歧化酶SOD，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4～6所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：秦江，刘喜朋，乐媛，
申请(专利权)人：上海巨朗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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