本发明专利技术属于植物分子生物学技术领域，具体为一种荠菜过氧化物酶基因及其在改良经济植物抗寒性中的应用。本发明专利技术荠菜过氧化物酶功能基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该核酸序列编码一个受低温诱导表达，在正常温度下低表达，表达后通过调节植物细胞中的活性氧，进一步促进细胞产生低温诱导相关基因，最终提高植物的抗寒力。利用该基因片段构建的过表达载体可以在植物中过量表达，进而调控抗冷基因表达，保护植物细胞免受低温伤害。本发明专利技术还提供了基于上述基因培育抗寒植物的应用方法，用于有经济价值农作物品种的改良。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物分子生物学
，具体涉及一种荠菜过氧化物酶基因，其制备方法，该基因的重组质粒，以及将其应用于植物逆境调控特别是用于经济植物抗寒基因的遗传转化，以提高植物抗寒性。
技术介绍
温度是植物生长过程中不可缺少的一种环境条件，植物作为固定生长的一种生物，不能通过行走移动躲避不良环境，更加受到环境因素的制约。低温冻害是农业生产中严重的自然灾害，不仅会限制农作物的栽种范围，也会造成农作物减产，每年引起的农作物的损失巨大，所以有关植物抗寒性的研究，改造农作物的遗传特性，使之从冻害中解脱出来，一直都是农业领域研究的热点之一，也是科学工作者的理想与追求。随着生物技术的发展和广泛应用，对抗寒分子机理的认识不断加深，采用现代生物技术培育抗寒新品种已成为主要手段之一。利用现代分子生物学技术，人们已从各种植物中克隆出众多参与植株耐低温能力形成的基因，这些基因均是植物在低温环境下诱导产生的一种特异基因，称为冷调节基因或冷驯化基因，它们所产生的蛋白质能够保护植物免受低温伤害，因此研究低温诱导基因的作用并将其应用于农作物改良有着重要的意义。近几年在模式植物拟南芥的研究中发现一类低丰度的低温诱导基因，称为RCI（Rare Cold Inducible）基因。拟南芥的RCI基因共分为四类，其中第三类为RCI3基因，该基因编码产物为一种阳离子过氧化物酶（Llorente F,López-Cobollo RM, Catalá R, Martínez-Zapater JM, Salinas J. A novel cold-inducible gene from Arabidopsis, RCI3, encodes a peroxidase that constitutes a component for stress tolerance. Plant J.2002,32(1):13-24），在植物中的作用为在低温胁迫下可增强植物细胞中活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的解毒功能从而提高植物的抗寒性（Kim MJ, Ciani S, Schachtman DP. A peroxidase contributes to ROS production during Arabidopsis root response to potassium deficiency. Mol. Plant. 2010, 3(2):420-427）。大量的研究表明当植物的外在条件发生急剧变化时，如在低温胁迫过程中，体内对O2的利用能力降低，多余的O2则在代谢过程中被转化成ROS，过多的ROS积累会对植物细胞造成损伤，植物中存在一种抗氧化防御机制来消除ROS的不利作用。同时ROS也是重要的信号调节分子，参与调控植物的生长发育以及各种胁迫反应。目前的研究发现植物中ROS的产生会影响多种基因的表达，说明植物细胞在进化的过程中已经获得了利用ROS作为信号分子的机制。ROS做为信号分子能够选择性地作用于一个能够感知ROS的目标蛋白，然后将这种信号传递下去从而调节某些基因表达的变化。在植物细胞中，ROS调控的结果有正面的，也有负面的，ROS的这种双面调控作用已在各种非生物胁迫中得到证实，因此，对ROS产生及清除机制中各种组分的功能研究将有助于更好的控制细胞中ROS的浓度。植物细胞中ROS的水平的调控对于提高作物的抗逆性具有良好的应用前景。荠菜（Capsella bursa-pastoris）是一种1或2年野生的草本植物，平铺地面，喜阴，在南方是处处可见的一种可食用蔬菜，属于十字花科（Cruciferae）、荠菜属（Capsella），在低温条件下例如早春和秋冬季节能够正常生长发育并开花结实。本专利技术所涉及的荠菜过氧化物酶基因是从荠菜叶片的基因组的DNA中克隆得到的。目前尚未发现有关荠菜过氧化物酶基因在培育耐寒植物中的报道。
技术实现思路
本专利技术的第一目的就是提供一种新的荠菜过氧化物酶基因，该基因是从荠菜的基因组中克隆得到的，是植物在冷诱导和冷驯化下产生的高表达的蛋白质。本专利技术的第二目的是提供一种新的荠菜过氧化物酶。本专利技术的第三目的是提供所述荠菜过氧化物酶及其基因序列在利用转基因技术改良植物抗逆（耐低温）上的应用。在本专利技术的一个方面，提供了一种分离出的DNA 分子，即一种新的荠菜过氧化物酶基因，该基因是从荠菜的基因组中克隆得到。该荠菜过氧化物酶基因，选自：（1）其核苷酸序列如SEQ ID No.1中第20-1532位碱基所示；（2）其核苷酸序列与SEQ ID No. l中从核苷酸第20-232；337-525；615-777；1116-1532位DNA分子的核苷酸序列有至少70％同源性、且编码相同功能蛋白质；或者（3）其核苷酸序列在中度严紧条件下与SEQ ID No.1中从核苷酸第20-1532位的核苷酸序列杂交、且编码相同功能蛋白质。在本专利技术的另一方面，还提供一种重组质粒，其包含上述荠菜过氧化物酶基因。在本专利技术的另一方面，还提供一种荠菜过氧化物酶, 其包括：具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，所述荠菜过氧化物酶为SEQ ID No.2 序列的多肽。在本专利技术的另一方面中，还提供了用于制备上述荠菜过氧化物酶基因的方法，所述方法包括以下步骤：（1）将荠菜种子经过70%酒精消毒后，播种于MS培养基上；（2）待所述荠菜种子长出叶片后，提取所述叶片的基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳分析其质量；以及（3）采用基因组步移技术克隆得到荠菜过氧化物酶基因基因组全长序列，其中，使用的上游引物为CbRCIF1：5-ATGAACTGCTTGAGAGCTATTGCCC-3（记为SEQ ID No.3），下游引物为CbRCIR：5-TTAACTATTTGCAACGGAACATTGCCT-3（记为SEQ ID No.4）。在本专利技术的另一方面中，还提供了用于制备上述重组质粒的方法，所述方法包括以下步骤：（1）设计引物对，扩增出上述荠菜过氧化物酶基因的完整DNA片段，所述引物对的上游引物为CbRCIF1：5-ATGAACTGCTTGAGAGCTATTGCCC-3（SEQ ID No.3），所述下游引物为CbRCIR：5-TTAACTATTTGCAACGGAACATTGCCT-3（SEQ ID No.4）；以及（2）将所述完整DNA片段克隆到中间载体pMD18-T，再进一步克隆到植物表达载体p1304上，得到上述重组质粒。在步骤（1）中，向所述上游引物引入限制性酶切位点NcoI，以及向所述下游引物引入限制性酶切位点BstEII。在本专利技术的另一方面中，还提供了上述荠菜过氧化物酶基因或上述重组质粒在植物抗寒性和耐寒性中的应用。较佳地，所述植物为具有经济价值的作物，更佳地包括水稻、小麦、玉米、棉花、油菜、番茄和黄瓜。在本专利技术的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是拟南芥、烟草和其它植物细胞等。在本专利技术的另一方面，还提供了一种产生具有荠菜过氧化物酶活性的多肽的方法，其步骤如下：（1）将编码具有荠菜过氧化物酶活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成荠菜过氧化物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从荠菜中分离的具有低温诱导特性的荠菜过氧化物酶基因，其特征在于，所述荠菜过氧化物酶基因的选自以下之一：（1）其核苷酸序列如SEQ ID No.1中第20‑1532位碱基所示；（2）其核苷酸序列与SEQ ID No. l中从核苷酸第20‑232；337‑525；615‑777；1116‑1532位DNA分子的核苷酸序列有至少70％同源性、且编码相同功能蛋白质；或者（3）其核苷酸序列在中度严紧条件下与SEQ ID No.1中从核苷酸第20‑1532位的核苷酸序列杂交、且编码相同功能蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种从荠菜中分离的具有低温诱导特性的荠菜过氧化物酶基因，其特征在于，所述荠菜过氧化物酶基因的选自以下之一：（1）其核苷酸序列如SEQ ID No.1中第20-1532位碱基所示；（2）其核苷酸序列与SEQ ID No. l中从核苷酸第20-232；337-525；615-777；1116-1532位DNA分子的核苷酸序列有至少70％同源性、且编码相同功能蛋白质；或者（3）其核苷酸序列在中度严紧条件下与SEQ ID No.1中从核苷酸第20-1532位的核苷酸序列杂交、且编码相同功能蛋白质。2.一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求1所述的荠菜过氧化物酶基因。3. 一种荠菜过氧化物酶，其特征在于，所述荠菜过氧化物酶选自以下之一：（1）其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或者（2）具有SEQ ID No.2氨基酸序列之多肽的保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。4.一种权利要求1所述的荠菜过氧化物酶基因的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将荠菜种子经过70%酒精消毒后，播种于MS培养基上；（2）待所述荠菜种子长出叶片后，提取所述叶片的基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳分析其质量；以及（3）采用基因组步移技术克隆得到荠菜过氧化物酶基因基因组全长序列，其中，使用的上游引物为：SEQ ID No.3，下游引物为SEQ ID No.4。5.一种权利要求2所述的重组质粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）设计引物对，扩增出权利要求1所述的荠菜过氧化物酶基因的完整DN...
【专利技术属性】
技术研发人员：林娟，李伟伟，陈虎，魏东晖，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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