本发明专利技术公开了一种优化的葡萄糖氧化酶基因GOD及其表达载体和应用，所述优化的葡萄糖氧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术以来源于黑曲霉的野生型葡萄糖氧化酶为基础，根据巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性对其进行了优化，优化后的GOD基因与野生型葡萄糖氧化酶基因的相似性为75%。优化后的GOD基因在毕赤酵母中表达后，获得了77U/mL的表达酶活，与野生型基因相比，表达酶活明显提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种优化的葡萄糖氧化酶基因及其表达载体和应用。
技术介绍
葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）是一种典型的氧化还原酶。它是一个分子量约160000道尔顿的蛋白质，有二个（或四个）多肽链构成，酶反应的最适pH 5-7，最适温度是30-40℃，催化时需要黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶参与作用。反应时葡萄糖先进行脱氢形成葡萄糖酸内酯，使FAD还原为还原型FAD，葡萄糖酸内酯进一步水解为葡萄糖酸。还原型FAD与空气中的氧反应形成过氧化氢。如果体系中存在过氧化物酶，过氧化氢则分解为水和氧。 葡萄糖氧化酶在工业生产中有诸多用途，在食品工业中，能够除氧保鲜，去葡萄糖，在饲料工业中，作为饲料添加剂，可以调节动物胃肠菌群平衡，增强机体免疫力，经过精制的葡萄糖氧化酶，可以用于医疗诊断, 如比色血糖试纸和基于生物传感器的血糖检测仪。葡萄糖氧化酶广泛存在于微生物中，工业上主要利用黑曲霉和青霉属菌株进行发酵生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一个优化的葡萄糖氧化酶基因GOD及其表达载体应用，本专利技术对来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的葡萄糖氧化酶的基因进行了密码子优化，与野生型基因相比，其在毕赤酵母中表达后获得的酶活有明显提高。为达到以上目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供了一种优化的葡萄糖氧化酶基因GOD，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本专利技术还提供了所述的葡萄糖氧化酶基因GOD产生的葡萄糖氧化酶，其具有序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本专利技术还提供了含有所述的优化的葡萄糖氧化酶基因GOD的重组表达载体。进一步的，所述重组表达载体为重组酵母表达质粒pPIC9K-GOD。本专利技术还提供了含有所述的重组表达载体的重组菌株。进一步的，所述重组菌株为重组毕赤酵母。进一步的，所述重组毕赤酵母为重组毕赤酵母GS115。本专利技术还提供了所述的优化的葡萄糖氧化酶基因GOD在用于生产葡萄糖氧化酶中的应用。进一步的，将所述的优化的葡萄糖氧化酶基因GOD与表达载体连接构建重组表达载体，将重组表达载体转化到宿主细胞中，获得重组宿主菌株，培养重组宿主菌株并诱导重组葡萄糖氧化酶的表达，获得葡萄糖氧化酶。本专利技术还提供了所述的葡萄糖氧化酶在用于制备动物饲料添加剂中的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术按照巴斯德毕赤酵母的（Pichia pastoris）的密码子偏好性及基因二级结构优化对野生型GOD基因进行优化，优化后的GOD基因序列与野生型序列同源性为75%。其编码的蛋白质共605个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本专利技术构建的含有经密码子优化的葡萄糖氧化酶基因的毕赤酵母工程菌能高效表达黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因，摇瓶发酵酶活达到77 U/ml。与含有野生型基因的工程菌相比，酶活提高了79%。本专利技术提供的此优化的葡萄糖氧化酶基因以及产生的葡萄糖氧化酶具有良好的市场应用前景和工业价值。附图说明图1为野生型GOD基因与本专利技术优化的GOD基因序列比对图，其中图1-1到图1-6合起来为完整的序列比对图；图2为野生型GOD基因和本专利技术优化的GOD基因在毕赤酵母中的表达情况比较。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，本专利技术的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。实施例1：葡萄糖氧化酶GOD基因的密码子优化根据NCBI数据库中的野生葡萄糖氧化酶基因序列（Genbank ID KJ774107.1）进行密码子优化。在对野生葡萄糖氧化酶基因序列优化的过程中，从密码子的优化指标中选取以下几点进行控制：1.密码子使用偏好。根据Pichia pastoris的密码子使用频率分布表，替换相应密码子，调整密码子适应指数（CAI）和最优密码子使用频率(FOP)。2.控制GC含量，防止出现容易导致提前终止的高AT序列。3.减少序列转录的mRNA二级结构中的稳定结构。4.避免过多的重复序列。5.避开密码子优化过程中产生的载体携带的限制性内切酶位点。如图1所示，优化获得的葡萄糖氧化酶基因GOD，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并构建在其提供的pGHn质粒上，为了适合在pPIC9K中表达，合成的基因已将野生基因携带的信号肽去除，并在序列两端引入EcoR I/Not I酶切位点。产生的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。实施例2：毕赤酵母工程菌Pichia pastoris pPIC9K-GOD的构建2.1 表达载体的构建将合成的得到的葡萄糖氧化酶基因GOD片段（SEQ ID NO：1），用快速限制性内切酶EcoR I、Not I进行双酶切，100uL酶切体系为：PCR产物 30uL，10×buffer 10 uL，EcoR I 3 uL，Not I 3 uL，ddH2O 54 uL。37℃酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳回收片段。将表达载体pPIC9k用限制性内切酶EcoR I、Not I进行双酶切，100uL酶切体系为：载体30 uL，10×buffer 10 uL，EcoR I 3 uL，Not I 3 uL，ddH2O 54uL。37℃酶切2h后，琼脂糖胶电泳回收片段。将经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的GOD片段和pPIC9k载体相连接构建表达载体pPIC9K-GOD。10uL连接体系为：GOD片段为2uL，pPIC9k载体为6uL，10×T4 DNA ligase buffer1uL，T4 DNA ligase 1uL。22℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布含氨苄青霉素终浓度100ug/mL的LB平板，37℃过夜培养。挑取转化子测序验证，测序验证正确的转化子转接到LB液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pPIC9K-GOD。2.2 毕赤酵母工程菌的构建及验证将重组质粒pPIC9K-GOD用SalI进行线性化，线性化片段用片段纯化试剂盒(TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purifibation Kit)纯化后，通过电转化方法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株。挑取单个阳性转化子转接于BMGY培养基中，30℃，220rpm振荡培养18h后，离心获得菌体，将适量菌体转入BMMY培养基中，使菌体浓度达到OD600的数值等于1，30℃，220rpm振荡培养，每24h添加培养体积1%的甲醇。诱导表达4d后，将培养液离心获得上清，将上清液进行葡萄糖氧化酶活力测定。酶活力检测方法：取邻联茴香胺缓冲液2.5mL(0.1mL1%邻联茴香胺甲醇储备液加入到12mL 0.1M pH6.0磷酸缓冲液配成)，18%葡萄糖溶液0.3mL，0.03%过氧化物酶溶液0.1mL，加入到比色管中37℃保温5 min，再加入0.1 mL葡萄糖氧化酶酶液（空白管加入0.1mL本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种优化的葡萄糖氧化酶基因GOD，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种优化的葡萄糖氧化酶基因GOD，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.权利要求1所述的葡萄糖氧化酶基因GOD产生的葡萄糖氧化酶，其特征在于其具有序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。3.含有权利要求1所述的优化的葡萄糖氧化酶基因GOD的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为重组酵母表达质粒pPIC9K-GOD。5.含有权利要求3所述的重组表达载体的重组菌株。6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于所述重组菌株为重组毕赤酵母。7...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖志壮，张稳，周莉芬，杜彦龙，
申请(专利权)人：青岛红樱桃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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