一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR1及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR1及其编码基因和应用，本发明专利技术使用易错PCR方法对Bacillus licheniformis来源的蛋白酶基因进行突变，再通过高通量筛选，获得蛋白酶突变体BLAPR1，相比于未突变的蛋白酶，本发明专利技术得到的蛋白酶突变体的热稳定性得到显著提高，具有良好的市场应用前景和工业价值。具有良好的市场应用前景和工业价值。具有良好的市场应用前景和工业价值。

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR1及其编码基因和应用


[0001]本专利技术属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR1及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]蛋白酶是催化水解蛋白质中肽键的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，有着许多不同的生理功能，是酶学研究开展的较早，也是最为成熟的一种。蛋白酶在各个领域中的应用愈加广泛，例如食品工业、酿酒酿造、洗涤剂行业、饲料工业、制革工业、丝绸行业和医药行业等，与我们的生活息息相关，这种环境下对蛋白酶的产量和特性改良方面都提出了更高的要求。
[0003]目前市场上大多数蛋白酶70℃处理后仅剩余酶活20%不到，总体耐温性能差，限制了蛋白酶的广泛使用。例如在饲料生产时，酶制剂与饲料混匀后要经过高温造粒，在此过程中酶易变性失活。因此提高蛋白酶的热稳定性至关重要。
[0004]易错PCR技术是在采用DNA聚合酶进行PCR反应扩增目的片段时，通过调整反应条件，增加扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，构建突变体文库，从而筛选需要的正向突变体。易错PCR技术可以很好地应用于蛋白质的分子改造中。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR1及其编码基因和应用，通过构建突变体文库和定向筛选的方法，对Bacillus licheniformis WX
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02来源的蛋白酶基因进行改良，筛选得到热稳定性提高的突变体，借此有助于提升其在饲料、食品或洗涤领域中的应用效果。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0007]本专利技术还提供了包含所述蛋白酶突变体编码基因的重组表达载体。
[0008]本专利技术提供了包含所述蛋白酶突变体编码基因的的基因工程菌，所述基因工程菌为枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌。
[0009]本专利技术提供了所述蛋白酶突变体的制备方法，包括以下步骤：1）重组基因工程菌构建：将所述蛋白酶突变体的编码基因连接到pUB110载体上，再将重组载体转化入枯草芽胞杆菌中，利用抗性标记筛选阳性克隆；2）重组基因工程菌摇瓶发酵：将验证正确的阳性克隆接种到摇瓶中发酵，震荡培养，发酵产生蛋白酶突变体；3）重组菌株放大发酵：将表达蛋白酶突变体的基因工程菌株接种到发酵罐中，从
而发酵产生蛋白酶突变体BLAPR1。
[0010]进一步的：所述步骤（3）发酵培养基包括以下成分：豆粕5
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10%、玉米粉1
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5%、PPG
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20000 0.1
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1.0%、蛋白酶0.1
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1.0%、淀粉酶0.1
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1.0%、磷酸氢二钠0.2
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0.5%，以质量比计。
[0011]本专利技术提供了所述蛋白酶突变体在用于制备饲料添加剂、食品添加剂和洗涤剂中的应用。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术以Bacillus licheniformis WX
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02来源的蛋白酶基因为基础，分别提供了包含A196C的单点突变体BLAPR1，分别包含I140C/A196C、K49E/A196C的双位点突变体BLAPR2和BLAPR3，以及包含 S191C/A196C/G308E的三位点突变体BLAPR4。
[0013]本专利技术改造后的突变体BLAPR1，BLAPR2，BLAPR3和BLAPR4在75℃处理3分钟时的热稳定性比原始蛋白酶分别提高了30.2％、64.0％、45.9％、39.0％。热稳定性得到了显著的提升。
[0014]所以通过本专利技术技术方案得到的蛋白酶突变体的热稳定性较野生型有较大提高，使其在饲料、食品或洗涤等领域有很好的应用潜力。具有良好的市场应用前景。
附图说明
[0015]图1是本专利技术中蛋白酶在30L发酵罐中的发酵数据。
[0016]图2是本专利技术中蛋白酶突变体在75℃水浴3min耐热性比较。
[0017]图3是本专利技术中蛋白酶突变体对豆粕抗性蛋白的降解效果（1、19是蛋白Marker；2、8、12、18是豆粕没有加酶；3
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7分别是加入200U/g的BLAPR0，BLAPR1，BLAPR2，BLAPR3和BLAPR4； 9
‑
13分别是加入400U/g的BLAPR0，BLAPR1，BLAPR2，BLAPR3和BLAPR4；13
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17分别是加入600U/g的BLAPR0，BLAPR1，BLAPR2，BLAPR3和BLAPR4）。
具体实施方式
[0018]为了便于理解本专利技术，以下将结合附图及实施例对本文专利技术做更全面、详细地说明，但本专利技术的保护范围并不限于以下具体实施例。
[0019]以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J .萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
[0020]1 菌株和载体枯草芽胞杆菌WB600，质粒pUB110，大肠杆菌BL21，质粒pET
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21a(+)购自Invitrogen公司。
[0021]2 试剂与培养基质粒提取试剂盒，片段纯化回收试剂盒，限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；GeneMorph II随机突变PCR试剂盒购自Stratagene公司；氨苄青霉素，IPTG等购自生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白Marker：Blue Plus II Protein Marker (14
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120 kDa) 购自北京全式金生物技术有限公司。LB培养基：1％胰蛋白胨，0 .5％酵母提取物，1％NaCl。
[0022]实施例1：易错PCR构建蛋白酶突变体文库
参考Bacillus licheniformis WX
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02来源的蛋白酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，和DNA序列(SEQ ID NO：2)，设计引物，在5
’
端设计Xba I限制性酶切位点，3
’
端设计BamH I限制性酶切位点。
[0023]SEQ ID NO：1MMRKKSFWLGMLTAFMLVFTMAFSDSASAAQPAKNVEKDYIVGFKSGVKTASVKKDIIKESGGKVDKQFRIINAAKAKLDKEALKEVKNDPDVAYVEEDHVAHALAQTVPYGIPLIKADKVQAQGFKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVGGASFVAGEAYNTDGNGHGTHVAGTVAALDNTTGVLG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。2.包含权利要求1所述蛋白酶突变体编码基因的重组表达载体。3.包含权利要求1所述蛋白酶突变体编码基因的的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌。4.权利要求1所述蛋白酶突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）重组基因工程菌构建：将所述蛋白酶突变体的编码基因连接到pUB110载体上，再将重组载体转化入枯草芽胞杆菌中，利用抗性标记筛选阳性克隆；2）重组基因工程菌摇瓶发酵：将验证正确的阳性克隆接种到摇瓶中发酵，震荡培养，发酵产生蛋白酶突变体；3）重组菌株放大发酵：将表达蛋白酶突...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖志壮，方安然，
申请(专利权)人：青岛红樱桃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：