碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用，碱性蛋白酶基因bcp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的碱性蛋白酶基因bcp，其全长为1143bp，在枯草芽孢杆菌表达菌株中进行高效表达，从而降低碱性蛋白酶BCP的生产成本。的生产成本。的生产成本。

【技术实现步骤摘要】
碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，特别地，涉及一种碱性蛋白酶基因。此外，本专利技术还涉及杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]蛋白酶能够分解蛋白质形成多肽以及游离氨基酸，在许多领域具有广泛的应用前景。蛋白酶来源广泛，目前产业化应用的蛋白酶主要来源于微生物，微生物来源蛋白酶具有种类多、酶学特性多样等特点。微生物来源的蛋白酶，根据作用pH可以分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶。这三种蛋白酶根据各自不同的酶学性质分别应用于不同的工业领域。其中碱性蛋白酶作为一种丝氨酸蛋白酶，具有良好的活性和稳定性，能够有效分解各种蛋白质，目前主要应用于食品加工、洗涤以及饲料等领域。碱性蛋白酶作为一种常用的工业酶制剂，市场上主流的碱性蛋白酶产品则是来源于嗜碱芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及枯草芽孢杆菌。碱性蛋白酶的生产方式则主要分为天然菌发酵培养和异源高效表达两大类。天然菌发酵培养的优点是发酵周期短，缺点则是酶活低、发酵过程不稳定及培养基组成复杂、菌种容易退化等。相对于天然菌，异源重组表达具备发酵酶活高、发酵过程稳定可控等优点，因此其成为主流的生产方式。目前碱性蛋白酶异源表达宿主包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌表达宿主的研究最多。枯草芽孢杆菌作为一种食品级表达宿主具有遗传操作简单、基因背景清晰、胞外分泌蛋白等优点。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供了一种碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用，以解决来源于芽孢杆菌的碱性蛋白酶的生产成本高、碱性蛋白酶发酵活力低的技术问题。
[0004]本专利技术采用的技术方案如下：
[0005]一种碱性蛋白酶基因bcp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]通过同源克隆获得环状芽孢杆菌碱性蛋白酶基因bcp。参照细菌基因组提取试剂盒提取环状芽孢杆菌基因组sy1(环状芽孢杆菌sy1由实验室前期从豆渣里面筛选获得)，根据NCBI数据库Bacillus circulans strain NCTC2610基因组序列(GenBank:UAPZ01000012.1：120935
‑
122077)设计一对引物，即正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示(bc1
‑
fw，5'
–
TCACGGCCG ATGAAGAAACTGTTGACGAAA
‑
3'，下划线为Ec52I酶切位点)，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示(bc1
‑
rev：5'
‑
ACGTCTAGAGCGTGTTGCCGCTTCTGC
‑
3'，下划线为XbaI酶切位点)。以提取的基因组为模板，通过PCR扩增获得碱性蛋白酶基因bcp。
[0007]上述碱性蛋白酶基因bcp为环状芽孢杆菌碱性蛋白酶基因bcp，其全长为1143bp，编码性蛋白酶BCP的380个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]根据本专利技术的另一方面，还提供了一种碱性蛋白酶BCP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过分析，基因bcp编码的碱性蛋白酶BCP可以分成三段，前27个氨基酸为其信号肽序列，28位氨基酸到111位氨基酸为其前导肽，112位氨基酸到269位氨基酸为其成熟肽(请确认，此处是否需要修改)。
[0009]通过NCBI蛋白比对分析发现碱性蛋白酶BCP与环状芽孢杆菌NCTC2610碱性蛋白酶(蛋白登录号：No.SPU21234.1)相似性最高，为90％；其次分别为克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(蛋白登录号：WP_094423791)和巴塔哥尼亚芽孢杆菌碱性蛋白酶(蛋白登录号：WP_094190329.1)，相似性分别为89.4％和78.7％。通过同源建模获得碱性蛋白酶BCP蛋白三维结构，由图1可知，BCP催化活性位点由第143位的天冬氨酸(D143)，第173位的组氨酸(H173)和第326位的丝氨酸(S326)催化三联体构成。蛋白表面的两段氨基酸之环(G
209
到S
215
，L
233
到S
239
)负责结合底物进行反应。此外BCP成熟肽还存在两个Ca
2+
结合位点，一个在蛋白表面，一个处于蛋白中间。
[0010]根据本专利技术的另一方面，还提供了一种用于在枯草芽孢杆菌中高效表达碱性蛋白酶的杂合启动子，杂合启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。杂合启动子的构建方法包括以下步骤：(1)PCR扩增获得碱性蛋白酶基因bcp，再通过琼脂糖凝聚纯化后用限制性内切酶XbaI和Eco521进行酶切，将酶切后的产物纯化，连接至表达载体pHY，通过筛选以及测序最终获得表达载体pHY
‑
bcp。(2)以构建好的pHY
‑
bcp为模板，分别构建不同启动子表达载体。筛选的启动子包括：P
cryIIIA
(苏云金芽孢杆菌结晶蛋白启动子)、P
Bsamy(
枯草芽孢杆菌中温淀粉酶启动子)、P
Baamy
(解淀粉芽孢杆菌中温淀粉酶启动子)、P
HpaII(
来源于表达载体pMA5q)、P
gsib
(来源于枯草芽孢杆菌)、P
Bsapr
(枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子)，P
Bsnpr
(枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子)和P
Blapr
(地衣芽孢碱性蛋白酶启动子)，启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.10所示。(3)采用电转化法将所有不同启动子表达载体转入枯草芽孢杆菌RIK1285，获得多个转化子。(4)多个转化子培养后进行酶活筛选，以确定单一最优启动子。(5)以单一最优启动子作为模板构建杂合启动子，重复步骤(3)、(4)，获得杂合启动子。杂合启动子为pHYP
Bsapr
‑
cryIIIA
‑
bcp，其对应的重组工程菌的酶活为2210U/mL，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
[0011]根据本专利技术的另一方面，还提供了一种重组表达载体，包括上述碱性蛋白酶基因bcp、权利要求3的杂合启动子和信号肽，信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。启动子和信号肽作为枯草芽孢杆菌重组表达的核心元件，在异源蛋白重组表达过程中发挥着重要作用。不同的酶对启动子和信号肽有选择性，因此蛋白酶在枯草芽孢进行异源表达，通过筛选获得最适启动子和信号肽。信号肽对其进行优化能够进一步提升碱性蛋白酶BCP在枯草芽孢杆菌RIK1285的表达量。所选的信号肽包括：SP
Bsamy
(枯草芽孢杆菌中温淀粉酶信号肽)、SP
Bsapr
(枯草芽孢杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种碱性蛋白酶基因bcp，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种碱性蛋白酶BCP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种用于在枯草芽孢杆菌中高效表达碱性蛋白酶的杂合启动子，其特征在于，所述杂合启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。4.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的碱性蛋白酶基因bcp、权利要求3所述的杂合启动子和信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。5.一种重组表达工程菌，其特征在于，包括权利要求4所述的重组表达载体。6.一种根据权利要求2所述的碱性蛋白酶BCP的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：提供碱性蛋白酶基因bcp、表达载体和表达菌株；对碱性蛋白酶基因bcp进行扩增，扩增产物与表达载体进行连接，获得重组表达载体；将重组表达载体基因整合到表达菌株，获得重组表达工程菌；对所述重组表达工程菌进行培养，获...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建荣，赵良忠，陈浩，李明，周小虎，周晓洁，黄展锐，
申请(专利权)人：邵阳学院，
类型：发明
国别省市：