一种碱性蛋白酶突变体及其用途制造技术

本发明专利技术主要通过DNA改组技术，利用DNaseI消化地衣芽胞杆菌来源和克劳氏芽胞杆菌来源的碱性蛋白酶基因，纯化回收目的片段，通过无引物PCR和有引物PCR构建碱性蛋白酶突变库，筛选获得了一种碱性蛋白酶活力显著提高的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。适宜条件下，突变体碱性蛋白酶活力为61.75U/mL，相比野生型有显著提高。生型有显著提高。生型有显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种碱性蛋白酶突变体及其用途


[0001]本专利技术属于微生物与基因工程
，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其用途。

技术介绍

[0002]蛋白酶是一种具有复杂结构与功能的水解酶，能够裂解肽键产生短肽或氨基酸。按照最适pH值的不同，蛋白酶可分为三种类型：酸性蛋白酶，最适pH为2.0～5.0，主要来源于真菌；中性蛋白酶，最适pH为7.0，主要来源于植物；碱性蛋白酶，最适pH为8.0及以上，主要来源于微生物。蛋白酶作为最重要的工业酶制剂之一，销售额占所有酶制剂销售量的60％以上，在洗涤剂、医药、食品、皮革、丝绸、摄影等领域有着广泛的应用。
[0003]合成洗涤剂被用作清洁剂已有100多年的历史。目前，合成洗涤剂已经成为世界各地人们日常生活中不可或缺的一部分。然而，合成洗涤剂中的磷酸盐等成分对生态系统的负面影响逐渐得到了人们的重视。因此，作为洗涤剂中有害化学物质的环保型替代品，洗涤剂酶已迅速发展成为一个包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶在内的广阔领域。洗涤剂工业中通常使用的酶是碱性酶，因为洗涤剂的pH值通常在9.0到12.0之间。在洗涤剂使用的碱性酶中，碱性蛋白酶占据首位，占全球蛋白酶销量的40％。因此，开发一种高活力的碱性蛋白酶有助于降低洗涤剂蛋白酶成本并提高洗涤剂蛋白酶的生产效率。
[0004]定向进化，又称非理性设计，它不需要依赖于可靠的蛋白质结构和结构
‑
功能关系等因素，而是在实验室中模拟自然进化机制，进而构建酶分子的体外进化条件，并定向筛选获得具有理想性能的突变体。DNA改组技术是定向进化技术的一种，该技术可以通过利用DNaseI将基因打断成一定的大小的片段,通过无引物PCR，使片段间发生错配，从而构建大型突变文库。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术目的在于提供一种碱性蛋白酶活力提高的碱性蛋白酶突变体。本专利技术主要通过DNA改组技术，利用DNaseI消化地衣芽胞杆菌来源和克劳氏芽胞杆菌来源的碱性蛋白酶基因，纯化回收目的片段，通过无引物PCR和有引物PCR构建碱性蛋白酶突变库，筛选获得了碱性蛋白酶活力显著提高的突变体。
[0006]本专利技术目的之一是，提供一种碱性蛋白酶突变体，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0007]本专利技术目的之二是，提供编码所述碱性蛋白酶突变体的基因。
[0008]在本专利技术一种具体实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0009]本专利技术目的之三是，提供包含所述碱性蛋白酶突变体的基因的载体。所述载体可以是本领域技术人员已知的通过基因重组制备蛋白质的载体之一，例如表达载体。
[0010]在本专利技术一种具体实施方式中，所述载体是pWB980。
[0011]本专利技术目的之四是，提供包含所述编码基因或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可
以是适合于从本专利技术的基因或载体生产本专利技术的碱性蛋白酶突变体的任何宿主，例如枯草芽孢杆菌。
[0012]在本专利技术一种具体实施方式中，所述宿主细胞是枯草芽胞杆菌WB600。
[0013]本专利技术目的之五是，提供本专利技术所述碱性蛋白酶突变体的用途，其用于水解蛋白质的肽键生成多肽或氨基酸；并且，所述碱性蛋白酶突变体相比野生型具有提高的碱性蛋白酶活力。
[0014]本专利技术目的之六是，提供制备本专利技术所述碱性蛋白酶突变体的方法，该方法通过利用本专利技术所述碱性蛋白酶突变体的编码基因或本专利技术所述载体进行基因重组和表达。可以使用本领域技术人员已知的基因重组方法和表达宿主，并选择适合于宿主表达的培养基和培养条件。所述方法还可以包括回收所述碱性蛋白酶突变体的步骤，该回收步骤可能涉及了将碱性蛋白酶突变体从宿主的培养物或表达产物中进行分离或纯化的步骤，可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。
[0015]有益效果：
[0016]1、本专利技术利用DNA改组技术，在体外对克劳氏芽胞杆菌来源碱性蛋白酶和地衣芽胞杆菌来源碱性蛋白酶进行定向进化，获得酶活力提高的碱性蛋白酶突变体PROM，适宜条件下，突变体碱性蛋白酶活力为61.75U/mL，相比亲本的克劳氏芽孢杆菌CPR(15.63U/mL)和地衣芽孢杆菌LPR(46.87U/mL)均有显著提高。
[0017]2、本专利技术利用碱性蛋白酶突变体的基因在芽胞杆菌表达系统中进行了表达，得到碱性蛋白酶突变体重组菌株，利用重组菌株发酵培养，从发酵产物中分离或纯化可得到碱性蛋白酶突变体。
附图说明
[0018]图1：CPR、LPR与突变体PROM的酶活力对比。
[0019]图2：突变体PROM的最适温度。
[0020]图3：突变体PROM的最适pH。
[0021]图4：突变体PROM的温度稳定性。
[0022]图5：突变体PROM的pH稳定性。
[0023]图6：突变体PROM与地衣芽孢杆菌LPR的蛋白胶图。
具体实施方式
[0024]下面通过具体的实施方案进一步叙述本专利技术。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。
[0025]本专利技术中采用如下定义：
[0026]1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
[0027]使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公
认IUPAC命名法。
[0028]2、碱性蛋白酶突变体的标识
[0029]在本专利技术中，cpr表示克劳氏芽胞杆菌来源碱性蛋白酶的基因序列(如SEQ ID NO：1所示)，lpr表示地衣芽胞杆菌来源碱性蛋白酶的基因序列(如SEQ ID NO：3所示)，prom则表示碱性蛋白酶突变体的基因序列(如SEQ ID NO：5所示)；CPR表示克劳氏芽胞杆菌来源碱性蛋白酶(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，LPR表示地衣芽胞杆菌来源碱性蛋白酶(如SEQ ID NO：4所示)，PROM表示碱性蛋白酶突变体(其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示)。
[0030]本专利技术所用培养基及酶活测定方法如下：
[0031]LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
[0032]枯草芽胞杆菌感受态制备培养基：
[0033]SP
‑
A盐溶液：(NH4)2SO
4 4g/L，K2HPO4·
3H2O 28g/L，KH2PO
4 12g/L，柠檬酸钠2g/L；
[0034]SP
‑
B盐溶液：MgSO4·
7H2O 0.4g/L；
[0035]100
×...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。2.编码权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的基因。3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述基因。4.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2所述基因或权利要求3所述重组载体。5.如权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述载体是pWB980。6.如权利要求4所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌WB600。7.权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的用...

【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，李玉，刘逸寒，杨子璇，宋广超，王兴吉，李庆刚，刘文龙，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：