本发明专利技术主要利用易错PCR技术对来源于克劳氏芽胞杆菌的碱性蛋白酶进行了定向改造，获得了一种胶原降解活力降低的碱性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQID NO：4所示。相同条件下，本发明专利技术突变体的碱性蛋白酶活力和胶原降解活力分别是野生型的91.97％和65.84％，该蛋白酶在皮革工业中具有较高的应用价值。工业中具有较高的应用价值。工业中具有较高的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种胶原降解活力降低的碱性蛋白酶突变体
[0001]本专利技术属于微生物与基因工程
，具体涉及一种胶原降解活力降低的碱性蛋白酶突变体及其应用。
技术介绍
[0002]蛋白酶是一种具有复杂结构与功能的水解酶，能够裂解肽键产生短肽或氨基酸。按照最适pH值的不同，蛋白酶可分为三种类型：酸性蛋白酶，最适pH为2.0～5.0，主要来源于真菌；中性蛋白酶，最适pH为7.0，主要来源于植物的；碱性蛋白酶，最适pH为8.0及以上，主要来源于微生物。蛋白酶作为最重要的工业酶制剂之一，销售额占所有酶制剂销售量的60％以上，在洗涤剂、医药、食品、皮革、丝绸、摄影等领域有着广泛的应用。
[0003]在皮革工业中，脱毛是皮革加工的主要步骤，即去除皮革上的毛发、表皮、非胶原蛋白和其他粘合物质。传统的脱毛工艺使用的是硫化钠，产生的大量含硫废弃物导致了严重的污染问题，此外，在制革鞣前准备中，大量的化工材料添加也造成了严重的环境隐患。目前，使用酶制剂代替化学品来进行清洁化生产的相关应用在制革中正受到越来越多的关注。然而，由于传统蛋白酶中的胶原降解蛋白酶活力较强，在应用过程中对皮胶原易造成损伤，导致松面、烂面等现象出现，极大的降低了经济效益，因此造成了蛋白酶在皮革工业中的应用局限性。因此，开发一种更适合皮革加工的蛋白酶能够提高在使用过程中的安全性，具有较高的应用需求与实践价值。
技术实现思路
[0004]针对现有技术的不足，本专利技术主要利用易错PCR技术对来源于克劳氏芽胞杆菌的碱性蛋白酶进行了定向改造，获得了一种胶原降解活力降低的碱性蛋白酶，该蛋白酶在皮革工业中具有较高的应用价值。
[0005]本专利技术目的之一是，提供一种碱性蛋白酶突变体，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0006]本专利技术目的之二是，提供编码所述碱性蛋白酶突变体的基因。
[0007]在本专利技术一种具体实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0008]本专利技术目的之三是，提供包含所述碱性蛋白酶突变体的基因的载体。所述载体可以是本领域技术人员已知的通过基因重组制备蛋白质的载体之一，例如表达载体。
[0009]在本专利技术一种具体实施方式中，所述载体是pWB980。
[0010]本专利技术目的之四是，提供包含所述编码基因或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是适合于从本专利技术的基因或载体生产本专利技术的碱性蛋白酶突变体的任何宿主，例如解淀粉芽孢杆菌。
[0011]在本专利技术一种具体实施方式中，所述宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218(生物保藏信息已公开于专利CN105087448B)。
[0012]在本专利技术另一具体实施方式中，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌WB600。
[0013]本专利技术目的之五是，提供本专利技术所述碱性蛋白酶突变体的用途，其用于水解蛋白质的肽键生成多肽或氨基酸，并且，其相比野生型具有降低的胶原降解酶活力。
[0014]本专利技术目的之六是，提供制备本专利技术所述碱性蛋白酶突变体的方法，该方法通过利用本专利技术所述碱性蛋白酶突变体的编码基因或本专利技术所述载体进行基因重组和表达。可以使用本领域技术人员已知的基因重组方法和表达宿主，并选择适合于宿主表达的培养基和培养条件。所述方法还可以包括回收所述碱性蛋白酶突变体的步骤，该回收步骤可能涉及了将碱性蛋白酶突变体从宿主的培养物或表达产物中进行分离或纯化的步骤，可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。
[0015]有益效果：
[0016]本专利技术通过易错PCR技术获得的碱性蛋白酶突变体，通过基因工程技术在芽孢杆菌表达系统中进行了重组和表达，相同条件下，本专利技术突变体的碱性蛋白酶活力和胶原降解活力分别是野生型的91.97％和65.84％，与野生型的碱性蛋白酶活力相当的同时对胶原的降解活力显著降低，在皮革工业中具有更高的应用价值。
附图说明
[0017]图1：实施例中野生型碱性蛋白酶基因的PCR扩增电泳图；其中：M为DNA Marker，1为alk基因。
[0018]图2：实施例中野生型与突变体的酶活力对比。
[0019]图3：实施例中野生型与突变体的温度稳定性对比。
[0020]图4：实施例中野生型与突变体的pH稳定性对比。
[0021]图5：实施例中野生型与突变体的纯化蛋白电泳验证。
[0022]图6：本专利技术碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列。
具体实施方式
[0023]下面通过具体的实施方案进一步叙述本专利技术。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。
[0024]本专利技术中采用如下定义：
[0025]1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
[0026]使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
[0027]2、碱性蛋白酶突变体的标识
[0028]采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。如Gly95Glu，表示第95位的氨基酸由亲本碱性蛋白酶的甘氨酸Gly替换成谷氨酸Glu，位置的编号对应于SEQ ID NO：2中碱性蛋白酶的氨基酸序列编号。如Gly95Glu/Gly258Met，表示第95位和第258位的氨基酸都发生了突变。
[0029]在本专利技术中，alk表示野生型碱性蛋白酶的基因序列，即原始序列(如SEQ ID NO：1所示)，alkm则表示碱性蛋白酶突变体的基因序列(如SEQ ID NO：3所示)；ALK表示野生型碱性蛋白酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，ALKM表示碱性蛋白酶突变体(其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)。突变前后的碱基及氨基酸对照如下表：
[0030]碱性蛋白酶碱基氨基酸ALK第537
‑
539位为GGG、第1026
‑
1028位为GGAGly95、Gly258ALKM第537
‑
539位为GAG、第1026
‑
1028位为ATGGly95Glu/Gly258Met
[0031]本专利技术技术方案概述如下：
[0032]通过易错PCR技术，对亲本克劳氏芽胞杆菌(Bacillus clausii)来源的野生型碱性蛋白酶alk基因序列进行随机突变，获得了一个突变体基因alkm。将突变体基因与质粒pWB980进行相同双酶切并连接获得重组载体，转入枯草芽孢杆菌宿主WB600中，最终电转到解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218中进行表达，纯化蛋白并验证其酶活力，获得了一种相比野生型胶原降解本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。2.编码权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的基因。3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述基因。4.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2所述基因或权利要求3所述重组载体。5.如权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述载体是pWB980。6.如权利要求4所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌WB600或解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218。7.权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的用途，其用于水解蛋白质的肽键生成多肽...
【专利技术属性】
技术研发人员：李玉，路福平，刘逸寒，李家霖，杨子璇，王兴吉，李庆刚，刘文龙，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：
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