【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及生物，具体涉及一种耐热木聚糖酶突变体及其应用。
技术介绍
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技术介绍
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1、木聚糖酶(ec 3.2.1.8)是一类包括多种内切酶和外切酶的复合酶系，能将木聚糖降解成低聚木糖或木寡糖，属于水解酶类。木聚糖酶在自然界中广泛分布，这对于降解自然界中的半纤维素起显著作用。已报道的能产木聚糖酶的微生物有细菌、链霉菌、曲霉、青霉、木霉等。另外，木聚糖酶在一些如蜗牛、海洋藻类、陆地植物组织、各种无脊椎动物和反刍动物瘤胃中也都存在。在发酵工业中霉菌和酵母菌应用广泛，工业发酵生产木聚糖酶的产生菌主要有：曲霉菌、青霉菌、芽孢杆菌属、链霉菌、酵母菌、木霉菌等。
2、木聚糖酶作为一种高效、绿色、安全的植物细胞壁水解酶类被广泛应用于实际生产中。微生物木聚糖酶来源广泛，品种多样，在一定程度上满足了工业生产的需求，在食品、饲料、制浆造纸、医药、化工、纺织、能源、环保等行业具有重要的应用价值。
3、木聚糖酶作为一种重要的饲用酶制剂，在家畜养殖中，向饲料中添加木聚糖酶后，能有效降解大分子物质，提高动物消化酶活性，促进营养物质的消化吸收。此外，木聚糖被降解后，由于低聚木糖能使双歧杆菌增殖，可有效的调节动物肠道微生态环境，从而提高动物的抗病及生产性能。为了适应不同饲料加工工艺及应用的需要，常需筛选耐高温的菌种，或采用基因工程及蛋白质工程手段改造木聚糖酶的属性，以满足各种因素对木聚糖酶的要求。
4、我国拥有着丰富的廉价木质纤维原料，每年产生的大部分农业木质纤维原料如玉米芯、麦麸、米糠、稻杆、玉米秆和甘蔗
5、野生菌株在发酵生产木聚糖酶的过程中存在很多缺点，如产量偏低、原料成本较高，难以大量发酵生产，且活力较低，另外天然木聚糖酶本身的一些酶学特性不能完全满足日益严苛的生产环境，在应用过程中受到一些限制。因此可以通过研究木聚糖酶在工程菌中的异源表达来实现木聚糖酶在实际应用中的限制问题。
6、本申请选择一株产木聚糖酶的木霉为实验材料，诱变并从中筛选克隆得到其中一个木聚糖酶基因，获得一种耐热的木聚糖酶突变体，并且通过构建毕赤酵母的表达载体，最终得到在毕赤酵母中表达较高木聚糖酶活力的工程菌，满足了纤维素生物转化工业生产和饲用酶制剂应用的需求，降低了生产成本，为进一步研究和开发工作奠定基础。
技术实现思路
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技术实现思路
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1、本专利技术的目的在于提供一种酶活、耐热性提高的木聚糖酶突变体及其毕赤酵母工程菌菌株。旨在解决木聚糖酶在工业生产中酶活力较低、纤维素生物转化、饲用酶制剂应用不理想的问题。
2、本专利技术具体通过以下技术方案实现：
3、首先由申请人实验室保藏的木霉(trichoderma sp.)m014经过artp诱变的方法筛选获得一株诱变株，将木聚糖酶突变体编码基因从诱变菌株中克隆并构建重组质粒后，在毕赤酵母gs115中进行表达，从而获得毕赤酵母工程菌菌株，并以此生产酶活、耐热性提高的木聚糖酶突变体。
4、本专利技术提供的技术方案之一：是一种木聚糖酶突变体，所述木聚糖酶突变体是在seq id no.2所示的m014野生型木聚糖酶的基础上，发生以下突变中的至少一种获得的：将其中第61位丝氨酸突变为苏氨酸、第64位谷氨酰胺突变为组氨酸、第82位天冬氨酸突变为组氨酸、第238位赖氨酸突变为精氨酸、或第240位异亮氨酸突变为天冬酰胺；
5、优选地，所述木聚糖酶突变体为同时发生上述五个位点突变的突变体ser61thr/gln64his/asp82his/lys238arg/ile240asn，氨基酸序列如序列表seq idno.4所示；
6、本专利技术还提供上述木聚糖酶突变体的编码基因；
7、进一步地，所述木聚糖酶突变体ser61thr/gln64his/asp82his/lys238arg/ile240asn的编码基因，核苷酸序列如序列表seq id no.3所示。
8、所述木聚糖酶突变体ser61thr/gln64his/asp82his/lys238arg/ile240asn的酶学性质如下：
9、(1)最适ph：ph 3.0-4.5酶活稳定，最适作用ph 3.5；
10、(2)最适温度：40℃-65℃酶活稳定，最适作用温度为45℃；
11、(3)耐热性：该酶在ph 3.5、温度70℃的条件下，24h后酶活力仍存留80％以上。
12、本专利技术提供的技术方案之二：是包含上述木聚糖酶突变体编码基因的重组载体或重组菌株，将上述木聚糖酶突变体编码基因重新构建重组载体，并在毕赤酵母中高效表达，得到产高活力木聚糖酶的重组菌株，通过发酵、提取等技术获得高活力木聚糖酶；
13、进一步地，用于表达所述的木聚糖酶突变体的宿主细胞为毕赤酵母gs115；
14、进一步地，用于表达所述的木聚糖酶突变体的表达载体为ppic9k质粒；
15、优选地，所述重组菌株是将seq id no.3所示的木聚糖酶突变体编码基因连接表达载体ppic9k，并在毕赤酵母gs115中表达所得。
16、本专利技术提供的技术方案之三：是技术方案二所述重组载体或重组菌株的应用，特别是在发酵生产seq id no.4所示的木聚糖酶突变体中的应用。
17、本专利技术提供的技术方案之四：是seq id no.4所示木聚糖酶突变体的应用，特别是在降解木聚糖中的应用；
18、进一步地，是在纤维素生物转化产业中的应用，如通过降解木质纤维原料中的木聚糖，使原料饲料化、能量化；
19、进一步地，是在饲用酶制剂中的应用，如在饲料中添加该木聚糖酶后，能有效降解大分子物质，提高动物消化酶活性，促进营养物质的消化吸收。
20、在本专利技术中采用如下定义：
21、1.氨基酸和dna核酸序列的命名法
22、使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用三字母或单字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。
23、2.木聚糖酶突变体的标识
24、采用“原始氨基酸+位置+替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如ser61thr表示位置61的氨基酸由野生型的ser替换成thr，位置的编号对应于seq id no.2中野生型木聚糖酶的氨基酸序列编号。在本专利技术中，mt-1表示野生型木聚糖酶，amt-2表示木聚糖酶突变体ser61thr/gln64his/asp82his/lys238arg/ile240asn，信息如下表：
25、
26、有益效果：
27、本专利技术公布了一种全新的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述木聚糖酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述木聚糖酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
4.含有权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，表达载体为pPIC9K质粒。
6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，宿主细胞毕赤酵母GS115。
7.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是将SEQ IDNo.3所示的木聚糖酶突变体编码基因连接表达载体pPIC9K，并在毕赤酵母GS115中表达所得。
8.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产权利要求1所述木聚糖酶突变体中的应用。
9.权利要求1所述木聚糖酶突变体的应用。
10.如权利要求9所述木聚糖酶突变体的应用，其特征在于，所述木聚糖酶突变体在分解木聚糖中的应用，或在纤维素生物转化、饲用酶制剂制备中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述木聚糖酶突变体氨基酸序列如seq id no.4所示。
2.权利要求1所述木聚糖酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq idno.3所示。
4.含有权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，表达载体为ppic9k质粒。
6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，宿主细胞毕赤酵母gs...
【专利技术属性】
技术研发人员：王克芬，曹世源，张强，刘文龙，张辉，张法玲，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：
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