一种碱性蛋白酶突变体及其制备制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其制备。本发明专利技术通过提取克劳氏芽孢杆菌基因组DNA，经PCR扩增得到野生型带有酶原区的碱性蛋白酶基因序列，将扩增得到的野生型碱性蛋白酶基因通过易错PCR进行随机突变，通过高通量筛选后获得了十六个高活力碱性蛋白酶基因。将这十六个突变体基因构建重组载体并在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌中成功表达，得到产酶活力提高的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得新型碱性蛋白酶。优化获得新型碱性蛋白酶。优化获得新型碱性蛋白酶。

【技术实现步骤摘要】
一种碱性蛋白酶突变体及其制备

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[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其制备。
技术背景：
[0002]碱性蛋白酶是指用于水解蛋白质或多肽并且在碱性环境下活力较高、稳定性较好的一类酶，其最适pH一般为9～11，与酸性和中性蛋白酶相比具有作用范围广、水解能力强等优点，是目前工业中用量较多的酶之一。碱性蛋白酶在现代工业中具有极其广泛的用途，是洗涤剂生产、食品工业、医药、饲料、化学工业、废物处理及皮革制造等行业中的重要酶制剂。在洗涤剂中对日常生活中常见的血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢具有广泛的洗涤效果，并且能够大幅度提高洗涤剂的去污能力；在食品行业可有效应用于动植物蛋白的加工，以改善蛋白食品的品质和风味，增强食品的营养和功能，制备生物活性肽等；在生物
，用于核酸纯化过程中蛋白质的去除，如海洋弧菌X4B
‑
7分离的碱性蛋白酶可解聚组蛋白，降解DNA酶；在制革工业中，利用酶法脱毛比传统灰碱法脱毛的污染更小，且反应条件温和、水解效率高，可以有效提高制革工业的生产效率和经济效益。
[0003]蛋白酶广泛存在于动物、植物和微生物中，由于微生物具有生长速度快，生长条件简单、代谢过程特殊和分布广等特点，使之成为生物酶的重要来源。碱性蛋白酶多来源于微生物，特别是工业微生物产生的碱性蛋白酶其水解能力与耐碱性具有更加明显的优势，与动植物来源的碱性蛋白酶相比，微生物碱性蛋白酶可分泌到细胞外，具有下游技术处理相对简单，价格低廉、来源广、菌易培养、同时易于实现工业化大批量生产等特点，因此，碱性蛋白酶研究已成为蛋白酶研究的热点。然而，酶活力不高仍是当前碱性蛋白酶工业化生产的一个最主要的限制因素，因此，开发高活力碱性蛋白酶对其实现工业化生产具有重要意义。
[0004]酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略。利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的结构酶。易错PCR(Error
‑
prone PCR)是体外定向进化常用方法，是指在扩增目的基因的同时，利用Taq酶不具备3
’→5’
校对功能，同时改变反应体系中Mn
2+
、Mg
2+
和各种dNTP的浓度，以一定的频率向目的基因随机引入碱基错配，导致目的基因发生随机突变。然而，经一次突变的基因一般很难获得满意的结果，由此又发展出连续易错PCR(Sequential Error
‑
prone PCR)策略，即将一次PCR扩增得到的产物作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行易错，使每一次获得的小突变不断进行积累而产生重要的有益突变。
[0005]芽孢杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效的分泌各种蛋白质；2、许多芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽孢杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，芽孢杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简
单的分离发酵液和细菌菌体可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。
[0006]因此，本专利技术中，通过易错PCR对来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因进行分子改造，利用枯草芽孢杆菌表达系统进行高通量筛选，得到酶活力提高的碱性蛋白酶突变体基因，并在解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌体系中成功表达。

技术实现思路
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[0007]本专利技术目的在于提供一种碱性蛋白酶突变体及其制备。
[0008]本专利技术为实现上述目的提供的技术方案之一为：以克劳氏芽孢杆菌CGMCC NO.12953基因组为模板，克隆出野生型碱性蛋白酶酶原区基因apr(SEQ ID NO.3所示)序列后(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，通过连续易错PCR对野生型碱性蛋白酶基因进行随机突变，再利用枯草芽孢杆菌表达系统进行高通量筛选获得十六个碱性蛋白酶高活力突变体基因。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案之二为：将上述突变体基因构建重组载体并在解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌中成功表达，得到产酶活力提高的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得新型碱性蛋白酶，其可应用在洗涤剂、制革、食品、饲料等领域。
[0010]在本专利技术中采用如下定义：
[0011]1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
[0012]使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
[0013]2、碱性蛋白酶高活力突变体的标识
[0014]采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。在本专利技术中，碱性蛋白酶的突变点位置按其成熟肽的氨基酸序列进行编号，位置的编号对应于SEQ ID NO.6中野生型碱性蛋白酶成熟肽的氨基酸序列编号，如Val145表示野生型碱性蛋白酶成熟肽氨基酸序列的第145位氨基酸为Val，Val145Ile表示位置145的氨基酸由野生型碱性蛋白酶的Val替换成Ile，也可用氨基酸单字母简称进行表示，如V145I；同时发生多位点突变的采用“/”连接各突变位点的方式表示，如V11I/G95V/V145I/N212S，表示位置11、95、145和212位的氨基酸依次由野生型碱性蛋白酶的V替换成I、由G替换为V、由V替换为I、由N替换为S；核苷酸表示方法与氨基酸表示方法类似，位置的编号对应于SEQ ID NO.5中野生型碱性蛋白酶成熟肽碱基序列编号，如G400，表示碱性蛋白酶成熟肽碱基序列的第400位碱基为G。
[0015]在本专利技术中，APR表示野生型碱性蛋白酶，即氨基酸原始序列(如SEQ ID NO.4所示)，其编码基因表示为apr(如SEQ ID NO.3所示)。用APRM加数字X的方式表示各个碱性蛋白酶突变体，各突变体的编码基因则以其氨基酸表示形式的小写斜体表示。
[0016]本专利技术中，所述碱性蛋白酶突变体是具有蛋白水解活性，其成熟肽是：
[0017](1)在SEQ ID NO.6所示的野生型碱性蛋白酶成熟肽基础上发生以下突变中的任意一种获得的：
[0018]V11I/G95V/V145I/N212S、V11L/G95V/V145I/N212S、
[0019]V11I/G95P/V145L/N212S、V11I/G95V/V145L/N212S、
[0020]V11L/G95P/V145I/N212S、V11L/G95P/V145L/N212S、
[0021]V11L/G95V/V145L/N212S、V11I/G95P/V145I/N212S、
[0022]V11I/G95P/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶的成熟肽是：(1)在SEQ ID NO.6所示的碱性蛋白酶的基础上，发生包含以下突变组合中的任意一种获得的：V11I/G95V/V145I/N212S、V11L/G95V/V145I/N212S、V11I/G95P/V145L/N212S、V11I/G95V/V145L/N212S、V11L/G95P/V145I/N212S、V11L/G95P/V145L/N212S、V11L/G95V/V145L/N212S、V11I/G95P/V145I/N212S、V11I/G95P/V145I/N212T、V11L/G95P/V145I/N212T、V11I/G95V/V145I/N212T、V11I/G95P/V145L/N212T、V11L/G95V/V145I/N212T、V11L/G95P/V145L/N212T、V11I/G95V/V145L/N212T或V11L/G...

【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，刘逸寒，王兴吉，李玉，王克芬，刘文龙，张元夫，刘夫锋，张会图，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：