一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明专利技术对角蛋白酶基因的前肽与主酶进行易错PCR突变，构建筛选得到低温酶解活性突变重组菌，得到角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D。研究结果显示角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D在20℃的剩余酶活提升至野生亲本角蛋白酶的2.28倍，在30℃的剩余酶活提升至野生亲本角蛋白酶的1.95倍。角蛋白酶的1.95倍。角蛋白酶的1.95倍。

【技术实现步骤摘要】
一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程


技术介绍

[0002]角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如角质，皮屑，羽毛等)的特异性角蛋白酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物以角蛋白为单一碳源生长时产生。角蛋白酶作为一种底物专一性较宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，广泛地运用于日化行业、畜牧行业、饲料行业、制革行业、医药行业中，具有巨大的研究与应用价值。
[0003]但是，目前研究发现的野生角蛋白酶多属于高温碱性蛋白酶，它们的最适反应温度一般为60℃左右，在20℃～40℃条件下的酶活一般不高。而且，在目前的研究当中，大多数都是针对其在较高的最适条件温度下进行酶活和热稳定性的研究，少有从角蛋白酶的实际应用环境出发，针对其低温性能进行改造的研究。
[0004]然而，在工业化与实际应用中，对角蛋白酶在较低温度下的性能有比较苛刻的要求，如制革工业中的浸水工艺要求角蛋白酶在室温条件(20℃～30℃)下有良好的酶解性能；在日化行业中，角蛋白酶相关的酶制剂及其衍生产品在应用时的温度也不高于40℃。虽然目前对角蛋白酶性质的研究日益成熟，但由于目前角蛋白酶的在低温条件下的酶活总体偏低，难以在需要较低反应温度的工业生产工艺和日常的大众化产品中实现大规模的应用。
[0005]虽然专利技术人课题组前期已经构建获得一株具有高角蛋白水解酶活的角蛋白酶重组菌，其在15L发酵罐上角蛋白酶活力达到426.60kU/mL(该角蛋白酶记载于文献Biotransformation of keratin waste to amino acids and active peptides based on cell
‑
free catalysis中)，并且随后专利技术人课题组也优化了一种高效生产角蛋白酶的方法，其在3L发酵罐水平酶活达到704.4kU/mL，是目前文献已报道的重组角蛋白酶表达的最高水平，且优化后发酵原料成本较优化前降低了96％(该产角蛋白酶方法记载于文献枯草芽孢杆菌高产角蛋白酶发酵条件优化中)；但是该酶是野生型角蛋白酶，其最适反应温度为65℃，在20～30℃时的酶活仅仅只有最适温度时的10～15％(在摇瓶水平下，野生型角蛋白酶在30℃的酶活为20.26kU/mL)。虽然该野生型角蛋白酶摇瓶发酵液在较低的反应温度下与现有报道中其他角蛋白酶在摇瓶水平发酵液相比具有高酶活，但其的低温酶活依然具有非常巨大的改进空间。
[0006]由于提高角蛋白酶的低温酶解性能有助于降低实际应用时的加热能耗而有效节省成本，降低反应温度从而防止角蛋白酶在高温环境下工作而快速失活，有效拓宽角蛋白酶在需要较低温度的工艺中或实际生活中的应用前景。因此，在实际应用中急需一种在低温条件下具有良好性能的角蛋白酶。

技术实现思路

[0007]技术问题
[0008]本专利技术要解决的技术问题是为了得到一种在低温条件下具有良好性能的角蛋白酶及其应用。
[0009]技术方案
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种角蛋白酶突变体，以提高角蛋白酶的低温酶解性能。
[0011]本专利技术提供了一种角蛋白酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶的第3位、第45位和第100位同时变得到的；其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶的序列包含前肽，组氨酸标签，和主酶；而本专利技术的突变体是从氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶的第111位开始算起的，即，从主酶的第一个氨基酸开始算起进行突变的。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶的第3位的苏氨酸突变为异亮氨酸，第45位的缬氨酸突变为天冬氨酸及第100位的丝氨酸突变为天冬氨酸得到的；将其命名为：T3I/V45D/S100D。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述角蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述角蛋白酶突变体T3I/V45D/S100D的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0015]本专利技术还提供了一种编码上述突变体的基因。
[0016]本专利技术还提供了携带上述基因的载体。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，以pHT01质粒或pP43NMK质粒为表达载体。
[0018]本专利技术还提供了一种携带上述基因，或上述载体的重组细胞。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，以细菌或真菌为表达宿主。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800N或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168。
[0021]本专利技术还提供了一种构建上述重组细胞的方法，所述方法为，将携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。
[0022]本专利技术还提供了一种降解角蛋白的方法，所述方法为，将上述突变体，或上述重组细胞添加至以含有角蛋白的物质为底物的反应体系中进行反应。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述含有角蛋白的物质包括但不限于以下一种或者多种物质：皮肤角质、毛发、酪蛋白、弹性蛋白、毛料、皮革、指甲、鳞片、纤维、毛发、羽毛。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，上述反应条件为：向反应体系中添加至少1000U
·
mL
‑1经纯化后的突变体T3I/V45D/S100D，在20℃～60℃，pH 7～11条件下反应4～12h。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，向反应体系中添加10000U
·
mL
‑1纯化后的突变体T3I/V45D/S100D，在37℃条件下反应4h。
[0026]本专利技术还提供了一种脱毛制剂，所述脱毛制剂中上述角蛋白酶突变体。
[0027]在本专利技术的一种实施方式中，所述脱毛制剂中角蛋白酶突变体的含量为1000～100000U
·
mL
‑1。
[0028]在本专利技术的一种实施方式中，所述脱毛制剂为液体或固体。
[0029]本专利技术还提供了上述脱毛制剂在动物或者人体中脱去毛发中的应用，其中，在人体中脱去毛发是不以治疗为目的。
[0030]本专利技术还提供了上述角蛋白酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组细胞在日化行业，畜牧业、饲料业、制革业、医药领域降解角蛋白中的应用。
[0031]本专利技术还提供了上述角蛋白酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组细胞在制备含有降解角蛋白的产品中的应用。
[0032]本专利技术还提供了上述角蛋白酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组细胞在降解皮肤角质、毛发、酪蛋白、弹性蛋白、毛本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种角蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶的第3位、第45位和第100位同时变得到的。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶的第3位的苏氨酸突变为异亮氨酸，第45位的缬氨酸突变为天冬氨酸及第100位的丝氨酸突变为天冬氨酸得到的。3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。4.携带权利要求3所述基因的载体。5.携带权利要求3所述基因，或权利要求4所述载体的重组细胞。6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，以细菌或真菌为宿主细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，李江华，周冠宇，陈坚，堵国成，冒鑫哲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：