一种提高角蛋白酶耐高温稳定性的结构域及其应用制造技术

本公开涉及一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶、一种分离的角蛋白酶、一种分离的角蛋白酶的片段、一种分离或人工合成的核酸、插入该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、提高角蛋白酶耐高温稳定性的方法以及该角蛋白酶降解羽毛的方法。本公开实现了角蛋白酶基因片段进行氨基酸优化，改善了角蛋白酶的耐高温效果，为工业及环境用角蛋白酶优化提供更多的改良策略。更多的改良策略。更多的改良策略。

【技术实现步骤摘要】
一种提高角蛋白酶耐高温稳定性的结构域及其应用


[0001]本公开涉及基因工程领域，具体地，涉及一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶、一种分离的角蛋白酶、一种分离的角蛋白酶的片段、一种分离或人工合成的核酸、插入该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、提高角蛋白酶耐高温稳定性的方法以及该角蛋白酶降解羽毛的方法。

技术介绍

[0002]角蛋白酶是一类能够特异性攻击角蛋白二硫键并降解角蛋白的一类酶，主要产自细菌。结构分析显示，角蛋白酶含有信号肽、N端前肽和成熟区，部分序列含有C端延伸结构。角蛋白酶成熟区也称催化结构域，由中央七股平行的β
‑
折叠和六个α
‑
螺旋组成主要的结构为活性位点中心和底物识别位点。活性位点中心为组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸组成的催化三联体。成熟区结构性质影响着角蛋白酶的性质，其能特异攻击二硫键以降解角蛋白，但热稳定性差等因素限制了角蛋白酶的工业应用。
[0003]目前发现的生物酶热稳定性普遍较差，不利于工业应用，因而对酶热稳定性的改良变得尤为重要。目前对酶稳定性的改造策略主要包括引入二硫键、氢键、盐桥、增加疏水作用力等方式，而在特定温度下酶的稳定性和柔性之间的平衡也是优化酶催化功能的关键。极端微生物在自然进化中适应了高温、低温、高压等极端环境，是极端酶基因资源的优质来源。
[0004]目前国内生产的酶制剂品种较为单一，不能满足工业需求，因而仍需要对具有特殊性能的优质酶资源进行开发。

技术实现思路

[0005]本公开的目的是提供一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶，该角蛋白酶通过定点突变的方式进行了耐高温稳定性的氨基酸优化，提高了角蛋白酶的耐高温稳定性，可应用于洗涤、食品、化妆品以及废弃物降解等领域。
[0006]第一方面，本公开提供一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]可选地，其中，所述角蛋白酶是将如戈壁异常球菌的角蛋白酶的Asn243
‑
Tyr276片段替换为嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn240
‑
Tyr274片段后得到的蛋白；
[0008]戈壁异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0009]嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]第二方面，本公开提供一种分离的角蛋白酶，该角蛋白酶是来源于嗜热异常球菌的角蛋白酶，且该角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]第三方面，本公开提供一种分离的角蛋白酶的片段，该角蛋白酶的片段是嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn240
‑
Tyr274片段，且该角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]第四方面，本公开提供一种分离的或人工合成的核酸，该核酸编码第一方面和第二方面中任意一项所述的角蛋白酶或第三方面所述的角蛋白酶的片段。
[0013]可选地，其中，所述基因是核苷酸序列为SEQ ID NO.5、7、8中任意一个所示的DNA分子。
[0014]第五方面，本公开提供一种重组载体，其中，所述重组载体插入有第四方面所述的基因；
[0015]优选地，所述重组载体是重组表达载体，且所述重组表达载体是核苷酸序列为SEQ ID NO.9或10所示的DNA分子。
[0016]第六方面，本公开提供一种转化体，其中，所述转化体的宿主为基因工程菌；所述转化体导入的核酸包括第四方面所述的核酸，或者，所述转化体中导入的重组载体包括第五方面所述的重组载体。
[0017]第七方面，本公开提供一种提高角蛋白酶的耐高温稳定性的方法，其中，所述方法包括：对原始的角蛋白酶进行重组改造，所述重组改造包括：将原始的角蛋白酶中对应于嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn243
‑
Tyr276片段的同源片段替换为嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn243
‑
Tyr276片段；
[0018]所述嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0019]所述原始的角蛋白酶中对应于嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn243
‑
Tyr276片段的同源片段，与嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn243
‑
Tyr276片段的一致性在80％以上。
[0020]第八方面，本公开提供一种降解羽毛的方法，其中，该方法包括，将羽毛与角蛋白酶接触进行酶解；
[0021]所述角蛋白酶为第一方面和第二方面中任意一项所述的角蛋白酶，或者为第七方面所述的方法得到的角蛋白酶；
[0022]优选地，所述酶解的温度为60
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80℃，时间为0
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200min。
[0023]更优选地，所述酶解的温度为65
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75℃，时间为10
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120min。
[0024]本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
[0025]图1角蛋白酶DgeKer的酶活特性(A)最适温度(B)60℃热稳定性(C)最适pH(D)pH耐受性。
[0026]图2角蛋白酶DgeKer的羽毛降解分析。
[0027]图3功能域Asn240
‑
Tyr274的序列分析。
[0028]图4功能域Asn240
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Tyr274提高了重组酶温度稳定性。
[0029]图5功能域Asn240
‑
Tyr274提高了重组酶高温下羽毛降解力。
[0030]序列表信息
[0031]1、SEQ ID NO.1：具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶的氨基酸序列。
[0032]2、SEQ ID NO.2：戈壁异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列。
[0033]3、SEQ ID NO.3：嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列。
[0034]4、SEQ ID NO.4：嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn240
‑
Tyr274片段的氨基酸序列。
[0035]5、SEQ ID NO.5、6、7：编码SEQ ID NO.1
‑
3的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0036]6、SEQ ID NO.8：编码嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn240
‑
Tyr274片段的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0037]7、SEQ ID NO.9：具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶重组表达载体的核苷酸序列。
[0038]8、SEQ ID NO.10：嗜热异常球菌的角蛋白酶重组表达载体的核苷酸序列。
具体实施方式
[0039]以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的角蛋白酶，其中，所述角蛋白酶是将如戈壁异常球菌的角蛋白酶的Asn243
‑
Tyr276片段替换为嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn240
‑
Tyr274片段后得到的蛋白；戈壁异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.一种分离的角蛋白酶，其特征在于，该角蛋白酶是来源于嗜热异常球菌的角蛋白酶，且该角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.一种分离的角蛋白酶的片段，其特征在于，该角蛋白酶的片段是嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn240
‑
Tyr274片段，且该角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.一种分离的或人工合成的核酸，该核酸编码权利要求1
‑
3中任意一项所述的角蛋白酶或权利要求4所述的角蛋白酶的片段。6.根据权利要求5所述的核酸，其中，所述基因是核苷酸序列为SEQ ID NO.5、7、8中任意一个所示的DNA分子。7.一种重组载体，其中，所述重组载体插入有权利要求5和6所述的基因；优选地，所述重组载体是重组表达载体，且所述重组表达载体是核苷酸序列为SEQ ID NO.9或10所...

【专利技术属性】
技术研发人员：林敏，周正富，张维，唐殷，王劲，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：