一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明专利技术的突变体为A165E、Q170T、N292F、L190Q、H92N和S171G，上述突变体在较好的保持催化活性的基础上使热稳定性获得不同程度提升，其中Q170T突变体具有最优热稳定性，在60℃的半衰期由野生型的17.3min提升到38.5min。六个位点组合突变体的半衰期显著改善至66.1min，最适反应温度由40℃提高至60℃。突变体的催化活性和热稳定性均较好，较野生型角蛋白酶更具应用价值和潜力。并且基于计算机辅助分析的蛋白质热稳定性提升方法可以成为工业酶热稳定性改造的通用途径。酶热稳定性改造的通用途径。酶热稳定性改造的通用途径。

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及应用


[0001]本专利技术属于基因工程及酶工程
，尤其是指一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及应用。

技术介绍

[0002]角蛋白酶具有专一的降解天然角蛋白的功能，是一种有着强生物活性的蛋白酶。大多属于胞外的丝氨酸蛋白酶类，少部分属于结合酶或胞内蛋白酶。目前文献报道的产角蛋白酶微生物主要来源于细菌、真菌或放线菌，这些微生物大多从羽毛，鸟类羽毛或毛发废弃物堆积处分离获得。角蛋白酶相比于其他蛋白酶可以更温和、高效地处理含有角蛋白的原料，同时其可以改善处理后的角蛋白的营养价值。目前，角蛋白酶广泛应用于医药、化工、饲料、纺织、制革等工业中，在生物制剂的制备、废弃生物资源的利用等方面具有重要的应用价值，因此关于角蛋白酶的研究备受关注。
[0003]高温有利于羊毛、羽毛、头发等角蛋白纤维的快速水解，并且水解过程通常需要持续进行一段时间，这就要求角蛋白酶具有较好的热稳定性能。而目前已报道的多数蛋白酶在工业环境下通常是不稳定的。在前期研究中发现，角蛋白酶KerBp在60℃下的失活半衰期仅约为17min，稳定性不足是制约角蛋白酶应用的瓶颈问题。提高蛋白酶的稳定性，尤其是提高未知结构蛋白酶的稳定性是一项具有挑战性的工作。传统的改造方法，如定向进化，费时费力；完全的理性设计则有局限性，尽管现在所能应用的蛋白质结构数据信息量在迅猛地增加，计算机技术水平也在增强，但是蛋白质构效关系尚未完全解析清楚。目前，计算生物学和定向进化的交叉结合进一步加速了酶的理性改造进程。借助于计算机辅助设计的蛋白质工程改造能够基于精确和全面的结构解析、先进的基因操作以及与多学科技术相结合的新方法为高效生产具有稳定性的酶开辟了新的领域。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术借助于计算机辅助计算与分析，分别对角蛋白酶的高柔性Loop区域、钙离子结合区域以及序列中的低频氨基酸进行定点突变和多位点组合突变的方法对短小芽孢杆菌角蛋白酶分子进行改造，构建出一种热稳定性提升的重组角蛋白酶工程菌株，同时也提供了一种有效的酶蛋白热稳定性改造策略。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种角蛋白酶突变体，以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶为亲本，将亲本角蛋白酶第165位点的丙氨酸、第292位点的天冬酰胺、第170位点的谷氨酰胺、第190位点的亮氨酸、第92位点的组氨酸、第171位点的丝氨酸中至少一处突变为其他的氨基酸。
[0006]在本专利技术的一个实施例中，将亲本角蛋白酶第165位点的丙氨酸突变为谷氨酸、第292位点的天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第170位点的谷氨酰胺突变为苏氨酸、第190位点的亮氨酸突变为谷氨酰胺、第92位点的组氨酸突变为天冬酰胺和第171位点的丝氨酸突变为甘氨酸中的至少一种突变。
[0007]在本专利技术的一个实施例中，将亲本角蛋白酶第165位点的丙氨酸突变为谷氨酸、第292位点的天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第170位点的谷氨酰胺突变为苏氨酸、第190位点的亮氨酸突变为谷氨酰胺、第92位点的组氨酸突变为天冬酰胺和第171位点的丝氨酸突变为甘氨酸。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供一种编码所述角蛋白酶突变体的基因。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组质粒。
[0010]本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述角蛋白酶突变体的重组菌。
[0011]在本专利技术的一个实施例中，所述的重组菌是以芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母或丝状真菌为宿主菌。
[0012]本专利技术的第五个目的是提供获得所述角蛋白酶突变体的预测、分析及筛选方法。
[0013]本专利技术的第六个目的是提供所述的角蛋白酶突变体在医药、化工、饲料、纺织或制革行业中的应用。
[0014]所述的角蛋白酶突变体在医药、化工、饲料、纺织或制革行业中的应用。
[0015]所述的重组菌在医药、化工、饲料、纺织或制革行业中的应用。
[0016]在本专利技术的一个实施例中，所述应用具体是将所述重组菌进行发酵，得到角蛋白酶突变体，将所述角蛋白酶突变体应用于医药、化工、饲料、纺织或制革行业中。
[0017]本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0018]本专利技术提供了一株基于计算机辅助计算与分析，分别对角蛋白酶的高柔性Loop区域、钙离子结合区域以及序列中的低频氨基酸进行定点突变和多位点组合突变的方法。获得了多个热稳定性提升突变体，其中多位点组合突变体在60℃的半衰期为66.1min，是野生型角蛋白酶的3.8倍；最适反应温度为60℃，较野生型提高了20℃。适合于工业化大规模生产，具有更好的应用价值和前景。并且利用计算机辅助计算与分析改造蛋白酶的方法可以成为工业酶热稳定性改造的通用途径。
附图说明
[0019]为了使本专利技术的内容更容易被清楚的理解，下面根据本专利技术的具体实施例并结合附图，对本专利技术作进一步详细的说明，其中
[0020]图1是本专利技术图1为角蛋白酶的高柔性Loop区域三维模拟结构；
[0021]图2为预测的钙离子结合氨基酸在三维结构上的分布示意图；
[0022]图3为角蛋白酶位点氨基酸频率分析及突变选择；
[0023]图4
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1、图4
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2与图4
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3为角蛋白酶的高柔性Loop区域定点突变结果；
[0024]图5为角蛋白酶的钙离子结合区域定点突变结果；
[0025]图6
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1、图6
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2为角蛋白酶的低频氨基酸突变结果；
[0026]图7为突变体Q170T和A165E热稳定性提升分子机制；
[0027]图8为突变体Q190L结构解析；
[0028]图9为序列趋同性突变体的结构解析；
[0029]图10为多位点组合突变结果；
[0030]图11为角蛋白酶在角蛋白提取中的应用；
[0031]图12为角蛋白酶在羽毛废弃物降解中的应用；
[0032]图13为角蛋白酶在制革脱毛中的应用。
具体实施方式
[0033]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0034]实施例1：角蛋白酶同源模型的构建
[0035]根据角蛋白酶基因kerBp的氨基酸序列在NCBI数据库中进行同源性比对，选择3种具有高同源性(大于60％)的晶体结构为模板，通过EasyModeller软件模拟该角蛋白酶的3D立体结构，利用SAVES在线分析服务器(http://servicesn.mbi.ucla.edu)的Verify 3D功能对所建模型进行质量评估。通过PyMOL和DiscoveryStudio软件进行立体结构的相关分析操作。
[0036]实施例2：角蛋白酶的高柔性Loop区域计算与分析
[0037]选用FoldUnfold以及IUPred蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶为亲本，将亲本角蛋白酶第165位点的丙氨酸、第292位点的天冬酰胺、第170位点的谷氨酰胺、第190位点的亮氨酸、第92位点的组氨酸、第171位点的丝氨酸中至少一处突变为其他氨基酸。2.根据权利要求1所述的角蛋白酶突变体，其特征在于，将亲本角蛋白酶第165位点的丙氨酸突变为谷氨酸、第292位点的天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第170位点的谷氨酰胺突变为苏氨酸、第190位点的亮氨酸突变为谷氨酰胺、第92位点的组氨酸突变为天冬酰胺和第171位点的丝氨酸突变为甘氨酸中的至少一种突变。3.根据权利要求2所述的角蛋白酶突变体，其特征在于，将亲本角蛋白酶第165位点的丙氨酸突变为谷氨酸、第292位点的天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第170位点的谷氨酰胺突变为苏氨酸、第190位点的亮氨酸突变为...

【专利技术属性】
技术研发人员：史劲松，苏畅，郑可欣，许正宏，龚劲松，钱建瑛，江佳宇，秦安琪，何纪萌，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：