一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用。所述蛋白质包括如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。本发明专利技术发现，短小芽孢杆菌来源的功能蛋白肽酶S8和肽酶M84具备较高的胰蛋白酶抑制剂降解能力，进一步利用毕赤酵母表达系统实现了这两种对于胰蛋白酶抑制剂有降解作用的肽酶的大量表达，利用本发明专利技术提供的方法制备得到的重组酶能够高效稳定降解胰蛋白酶抑制剂，且能够应用于豆粕中胰蛋白酶抑制剂的降解。降解。降解。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用。

技术介绍

[0002]胰蛋白酶抑制剂(KTI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，是大豆中的主要抗营养因子之一，约占豆粕总量的2％。研究表明，过多食用胰蛋白酶抑制剂含量丰富的食物会降低生物体对营养物质的消化吸收水平，甚至出现胰腺肥大或增生的情况。目前，对胰蛋白酶抑制剂的灭活方法除了物理法、化学法外，利用微生物对豆类原料进行发酵，来降解胰蛋白酶抑制剂也已经成为较为常用的方法。
[0003]芽孢杆菌属可能是细菌纲中最古老和最多样化的属，由于其生长速度快、发酵周期短、可以分泌蛋白质到细胞外培养基的特性，被广泛用于不同的行业。其产生的蛋白酶大多数是胞外蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。芽孢杆菌来源的蛋白水解酶以碱性为主，最适pH值通常在7.0以上，其分子量跨度范围较大，一般在27
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71kDa之间，最优温度在37℃到60℃之间。因芽孢杆菌蛋白酶这些显著的特点，它被应用于在许多行业，如在洗涤工业中，用于去除织物的污渍；在食品行业中，用来获得生物活性肽，加工不同的食品等。食品工业中的许多蛋白都可以用重组的毕赤酵母菌株生产，由于其在重组蛋白分泌方面的优异性能，且宿主细胞自身蛋白的分泌水平较低，因此可以很容易地从上清中获取重组蛋白，来制备具有特殊功能的高质量重组酶。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用；
[0006]所述蛋白质包括如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
[0007]进一步地，所述蛋白质由SEQ ID NO.2和/或如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列编码得到。
[0008]进一步地，所述蛋白质为通过在微生物中表达得到。
[0009]进一步地，通过将如SEQ ID NO.2和/或如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列构建至表达载体上，转化至所述微生物中诱导表达得到所述蛋白质。
[0010]进一步地，将所述蛋白质在微生物中表达包括如下流程：
[0011](1)将如SEQ ID NO.2和/或如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列构建至表达载体上，转化至毕赤酵母中；
[0012](2)将所述毕赤酵母接种于种子培养基中进行种子培养；
[0013](3)将在种子培养基中培养成熟的毕赤酵母至于诱导培养基中进行诱导表达；
[0014](4)分离诱导表达后的培养基上清液，纯化。
[0015]进一步地，步骤(2)中种子培养基为含有3％～5％甘油的BMGY培养基；培养条件为在29～31℃、225～275r/min的条件下培养；
[0016]进一步，步骤(3)中诱导培养基为含有0.5～1.5％甲醇的BMMY培养基；培养条件为在29～31℃、225～275r/min的条件下培养；
[0017]进一步地，在步骤(3)的诱导表达的过程中，添加甲醇维持其浓度为体积百分比为0.5％～1.5％。
[0018]进一步地，步骤(3)中诱导表达的时间为4～7天，优选为4～5天。
[0019]进一步地，步骤(4)中的纯化包括硫酸铵沉淀、透析、超滤和蛋白纯化柱纯化中的一种或多种，优选为超滤。
[0020]进一步地，为了延长成熟肽酶S8和肽酶M84的保存时间，还包括步骤(5)在
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80℃真空冷冻干燥将纯化后的蛋白制备为蛋白粉末。
[0021]进一步地，所述微生物为短小芽孢杆菌、大肠杆菌或毕赤酵母中的一种或多种。
[0022]所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌LZ013
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2。
[0023]第二方面，本专利技术提供一种重组微生物，所述重组微生物中编码肽酶S8和肽酶M84的核苷酸序列的信号肽序列缺失；
[0024]所述肽酶S8包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述肽酶M84包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
[0025]进一步地，所述重组微生物的出发菌株为短小芽孢杆菌、大肠杆菌或毕赤酵母中的一种或多种。
[0026]所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌LZ013
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2。
[0027]第三方面，本专利技术提供一种核酸，所述核酸包括如SEQ ID NO.2和/或如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0028]本专利技术进一步提供包括所述核酸的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
[0029]本专利技术具备如下有益效果：
[0030]本专利技术发现短小芽孢杆菌来源的功能蛋白肽酶S8和肽酶M84具备较高的降解胰蛋白酶抑制剂的能力，并进一步对肽酶S8以及肽酶M84的编码基因进行密码子优化，通过毕赤酵母表达系统实现了这两种肽酶的大量表达，获得了能够高效稳定降解KTI的重组酶。
[0031]本专利技术通过对重组毕赤酵母的诱导时间、甘油及甲醇添加量等培养和诱导条件进行优化，进一步提高了肽酶S8以及肽酶M84的表达量。本专利技术进一步在豆粕体系中进行验证，为重组肽酶的应用提供了有效依据和基础。
附图说明
[0032]图1为本专利技术试验例1提供的不同诱导时间对于重组酶的表达量的影响示意图。
[0033]图2为本专利技术试验例1提供的不同甘油浓度对于重组酶的表达量的影响示意图。
[0034]图3位本专利技术试验例1提供的不同甲醇添加浓度对于重组酶的表达量的影响示意图。
具体实施方式
[0035]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0036]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，巴斯德毕赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)购自Invitrogen公司；限制性内切酶SacⅠ、DNA Marker DL2000、DL15000购自TaKaRa宝日医生物技术(北京)有限公司；所用培养基均购自于北京索莱宝有限公司。紫外96孔板(96Well Microplate,Chimney Well)购自Greiner bio
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one公司。酶标仪购自芬兰Thermo Multiscan Ascent。
[0038]实施例1
[0039]本实施例提供一种制备具有降解胰蛋白酶抑制剂的能力的蛋白质的方法，包括如下流程：
[0040]1、肽酶S8和肽酶M84编码基因的密码子优化
[0041]首先利用生物信息学软件对肽酶S8和肽酶M84的信号肽区域进行分析，确定去除C端信号肽的肽酶S8和肽酶M84成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示，根本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用；所述蛋白质包括如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质由SEQ ID NO.2和/或如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列编码得到。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为通过在微生物中表达得到。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过将如SEQ ID NO.2和/或如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列构建至表达载体上，转化至所述微生物中诱导表达得到所述蛋白质。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在所述诱导表达的过程中，添加甲醇维持其浓度为体积百分比为0.5％～1.5％。6.根据权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：梁志宏，黄昆仑，花蕴，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：