枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法技术

本文公开了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、编码其的核酸以及与其生产和使用有关的组合物和方法，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包括与一种或多种参比枯草杆菌蛋白酶相比具有改善的稳定性和/或污垢去除性的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。种枯草杆菌蛋白酶变体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法
[0001]本申请要求于2019年5月24日提交的美国临时申请62/852,337和于2019年10月24日提交的美国临时申请62/925,265的优先权，将所述申请的全部内容通过引用特此并入。
[0002]以电子方式递交的序列表的引用
[0003]所述序列表的官方副本经由EFS
‑
Web作为ASCII格式的序列表以电子方式递交，文件名为20200520_NB41644PCT_SeqLst，创建于2020年5月20日，且具有11千字节大小，并与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。
[0004]本文公开了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、编码其的核酸以及与其生产和使用有关的组合物和方法，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包括与一种或多种参比枯草杆菌蛋白酶相比具有改善的稳定性和/或污垢去除性的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。

技术介绍

[0005]蛋白酶(也称为朊酶)是指具有分解其他蛋白质的能力的酶。蛋白酶具有通过在形成蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键的水解来开始蛋白质分解代谢以进行蛋白水解的能力。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为蛋白水解活性。存在许多熟知的程序用于测量蛋白水解活性(Kalisz,“Microbial Proteinases[微生物朊酶],”在：Fiechter(编辑),Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生化工程/生物技术进展],(1988)中)。例如，蛋白水解活性可以通过分析各个蛋白酶水解商业底物的能力的比较测定来确定。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(西格玛公司(Sigma)C
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9801)、牛胶原(西格玛公司C
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9879)、牛弹性蛋白(西格玛公司E
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1625)和牛角蛋白(ICN生物医学公司(ICN Biomedical)902111)。使用这些底物的比色测定是本领域熟知的(参见例如WO 99/34011和美国专利号6,376,450，这两者都通过引用并入本文)。
[0006]丝氨酸蛋白酶是具有启动蛋白质肽键水解的活性位点丝氨酸的酶(EC编号3.4.21)。丝氨酸蛋白酶包含种类繁多的具有广泛特异性和生物学功能的酶，基于这些酶的结构，这些酶被进一步划分为胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)和枯草杆菌蛋白酶样。原型枯草杆菌蛋白酶(EC编号3.4.21.62)最初从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)获得。枯草杆菌蛋白酶及其同源物是MEROPS分类方案的S8肽酶家族的成员(Rawlings,N.D等人(2016)Twenty years of the MEROPS database of proteolytic enzymes,their substrates and inhibitors[蛋白水解酶及其底物和抑制剂的二十年MEROPS数据库].Nucleic Acids Res[核酸研究]44,D343
‑
D350)。S8家族的成员在其氨基酸序列中具有顺序为Asp、His和Ser的催化三联体。尽管已经开发了许多可用于清洁应用的变体蛋白酶，但是仍然需要改善的蛋白酶变体。

技术实现思路

[0007]一个实施例涉及吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含
选自由以下组成的组的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代：S039E、S099R、S126A、D127E和F128G，并且进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个另外的取代：N074D、N085R、N116R、G160Q、R179Q、N198A/G/L/Q/R/S/T/V、Q200L、R207Q、M211E/L/N/Q、N212Q/S、N242D、N253P和Q256E，其中所述氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。在一个实施例中，所述吉氏芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶变体包含所述取代S039E
‑
S099R
‑
S126A
‑
D127E
‑
F128G。在一些实施例中，所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性。在另一个实施例中，提供了吉氏芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含选自由以下组成的组的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代：S039E、S099R、S126A、D127E和F128G，其中所述取代包含i)至少一个选自由S039E、S099R、S126A、D127E和F128G组成的组的取代；ii)选自S039E
‑
S099R、S039E
‑
S126A、S039E
‑
D127E、S039E
‑
F128G、S099R
‑
S126A、S099R
‑
D127E、S099R
‑
F128G、S126A
‑
D127E、S126A
‑
F128G和D127E
‑
F128G的取代的组合；iii)选自S039E
‑
S099R
‑
S126A、S039E
‑
S099R
‑
D127E、S039E
‑
S099R
‑
F128G、S039E
‑
S126A
‑
D127E、S039E
‑
S126A
‑
F128G、S039E
‑
D127E
‑
F128G、S099R
‑
S126A
‑
D127E、S099R
‑
S126A
‑
F128G、S099R
‑
D127E
‑
F128G和S126A
‑
D127E
‑
F128G的取代的组合；iv)选自S039E
‑
S099R
‑
S126A
‑
D127E、S039E
‑
S099R
‑
S126A
‑
F128G、S039E
‑
S099R
‑
D127E
‑
F128G、S039E
‑
S126A
‑
D127E
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F128G和S099R
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S126A
‑
D127E
‑
F128G的取代的组合；以及v)S039E
‑
S099R
‑
S126A
‑
D127E
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)枯草杆菌蛋白酶变体，其包含选自由以下组成的组的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代：S039E、S099R、S126A、D127E和F128G，并且进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个另外的取代：N074D、N085R、N116R、G160Q、R179Q、N198A/G/L/Q/R/S/T/V、Q200L、R207Q、M211E/L/N/Q、N212Q/S、N242D、N253P和Q256E，其中所述变体与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少80％同一性。2.如权利要求1所述的吉氏芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶变体，其中选自由S039E、S099R、S126A、D127E和F128G组成的组的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代包含i)选自由S039E、S099R、S126A、D127E和F128G组成的组的一个或多个取代；ii)选自S039E
‑
S099R、S039E
‑
S126A、S039E
‑
D127E、S039E
‑
F128G、S099R
‑
S126A、S099R
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D127E、S099R
‑
F128G、S126A
‑
D127E、S126A
‑
F128G和D127E
‑
F128G的取代的组合；iii)选自S039E
‑
S099R
‑
S126A、S039E
‑
S099R
‑
D127E、S039E
‑
S099R
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F128G、S039E
‑
S126A
‑
D127E、S039E
‑
S126A
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F128G、S039E
‑
D127E
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F128G、S099R
‑
S126A
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D127E、S099R
‑
S126A
‑
F128G、S099R
‑
D127E
‑
F128G和S126A
‑
D127E
‑
F128G的取代的组合；iv)选自S039E
‑
S099R
‑
S126A
‑
D127E、S039E
‑
S099R
‑
S126A
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F128G、S039E
‑
S099R
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D127E
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F128G、S039E
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S126A
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D127E
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F128G和S099R
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S126A
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D127E
‑
F128G的取代的组合；以及v)S039E
‑
S099R
‑
S126A
‑
D127E
‑
F128G的组合。3.如权利要求1或2所述的吉氏芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含：i)进一步与选自由N074D、N198G、M211Q、N212Q和N242D组成的组的一个或多个取代组合的取代S099R；ii)与选自由N074D、N198G、N212Q和N242D组成的组的一个或多个取代组合的取代S039E
‑
S099R；iii)与选自由N198G、M211Q、N212Q和N242D组成的组的一个或多个取代组合的取代S099R
‑
F128G；iv)与选自由M211Q、N212Q和N242D组成的组的一个或多个取代组合的取代S039E
‑
S099R
‑
F128G；或v)与选自由N074D、N212Q和N242D组成的组的一个或多个取代组合的取代S099R
‑
S126A
‑
F128G；vi)与选自由N074D、M211Q和N212Q组成的组的一个或多个取代组合的取代S039E
‑
S099R
‑
D127E；或vii)与选自由N074D、N198A、M211Q、M211E和N242D组成的组的一个或多个取代组合的取代S099R
‑
S126A
‑
D127E
‑
F128G。4.如任一项前述权利要求所述的吉氏芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶变体，其中选自由S039E、S099R、S126A、D127E和F128G组成的组的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代包含i)选自由S039E、S099R、S126A、D127E和F128G组成的组的一个或多个取代；ii)选自S039E
‑
S099R、S039E
‑
S126A、S039E
‑
D127E、S039E
‑
F128G、S099R
‑
S126A、S099R
‑
D127E、S099R
‑
F128G、S126A
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D127E、S126A
‑
F128G和D127E
‑
F128G的取代的组合；iii)选自S039E
‑
S099R
‑
S126A、S039E
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S099R
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D127E、S039E
‑
S099R
‑
F128G、S039E
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S126A
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D127E、S039E
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S126A
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F128G、S039E
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D127E
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F128G、S099R
‑
S126A
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D127E、S099R
‑
S126A
‑
F128G、S099R
‑
D127E
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F128G和S126A
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D127E
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F128G的取代的组合；iv)选自S039E
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S099R
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S126A
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D127E、S039E
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S099R
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S126A
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F128G、S039E
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S099R
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D127E
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F128G、S039E
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S126A
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D127E
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F128G和S099R
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S126A
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D127E
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F128G的取代的组合；以及v)S039E
‑
S099R
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S126A
‑
D127E
‑
F128G的组合；并且其中所述变体进一步包含一个或多个另外的取代、或一组取代，所述取代选自由以下组成的组：N074D
‑
M211L
‑
N253P、R179Q
‑
M211L
‑
N253P、N074D
‑
N253P、N085R
‑
G160Q
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R179Q
‑
M211L
‑
N212S
‑
N253P、R179Q
‑
N253P、G160Q
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R179Q
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M211L
‑
N212S
‑
N253P、R179Q
‑
M211L、G160Q
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R179Q
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M211L
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N253P、G160Q
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R179Q
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N212S
‑
N253P、N074D
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M211L、M211L
‑
N242D、G160Q
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R179Q
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M211L
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N212S、N074D
‑
R179Q
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M211L
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N253P、G160Q
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R179Q
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M211L、G160Q
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R179Q
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N253P、N074D
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Q200L
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M211L、N074D
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G160Q
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N212S
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N253P、N074D
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G160Q
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M211L
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N253P、G160Q
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R179Q、G160Q
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R179Q
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N212S、N074D
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G160Q
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N253P、N074D
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G160Q
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R179Q
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M211L
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N212S
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N253P、N074D
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N085R
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G160Q
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R179Q
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M211L、N074D
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G160Q
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M211L
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N212S
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N253P、N074D
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N085R
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N116R
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Q200L
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Q256E、N074D
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G160Q
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R179Q
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N212S
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N253P、N074D
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G160Q
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M211L
‑
N212S、N0...

【专利技术属性】
技术研发人员：V，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：