一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术提供了一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用，具体是在篮状菌属Talaromyces来源的酸性木聚糖酶XYNTF0的基础上通过大量突变和筛选获得的木聚糖酶突变体XYNTF01、XYNTF02、XYNTF03、XYNTF04和XYNTF05；相比于未突变的木聚糖酶，本发明专利技术得到的木聚糖酶突变体的酶活和耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的开发和应用。

A Kind of Acidic Xylanase Mutants with Enzyme Activity and Heat Tolerance Improvement and Their Coding Genes and Applications

【技术实现步骤摘要】
一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一类酶活和耐热提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用。
技术介绍
木聚糖是存在于植物细胞壁上一种多聚五碳糖，是半纤维素的主要成分，约占植物细胞干重的15％～35％。木聚糖由木糖单体通过β-1，4-糖苷键聚合而成。内切-1，4-β-D-木聚糖酶，简称木聚糖酶(xylanase)，通过随机的内切水解木聚糖主链的1，4-β-D-糖苷键，产生木糖或低聚木糖，是木聚糖降解过程中的关键酶。在养殖行业中，饲料中的木聚糖在动物消化系统中不能被有效的降解，同时还会影响其他营养成分的吸收利用，大大降低了饲料的转化效率。因此，通过在饲料中添加木聚糖酶转化抗营养因子木聚糖对提高饲料转化率非常经济有效。饲料生产时，酶制剂与饲料混匀后要经过高温造粒，在此过程中酶易变性失活；同时添加到饲料中的酶制剂通常需要在胃肠道中发挥作用，胃液的酸性环境极易使得中性木聚糖酶变性失活，影响使用效果；因此开发耐热的酸性木聚糖酶有利于其在饲料行业的应用。目前市场上大多数木聚糖酶最适反应温度在40-70℃之间，最适pH在5.0-7.0之间，在经历高温和胃酸后极易失活，解决这类问题的一种方法是利用包被剂和载体来提高酶的稳定性，但这无疑会增加酶制剂的生产成本，而且采用包被处理酶制剂会严重影响其生物利用率；另一种经济有效的方法就是通过改良酶的基因提高其稳定性。从酶的基因和结构入手，筛选得到耐热的酸性木聚糖酶对降低目前饲用木聚糖酶的生产成本，提高其利用效率具有重要的意义。易错PCR技术是通过PCR反应扩增目的片段时，通过调整反应条件增加扩增时的突变频率，从而向目的基因中引入随机突变，构建突变体库，从而筛选需要的正向突变体。为了获得更好的突变效果，可以将一次突变筛选得到的正突变基因作为下一次易错PCR的模板，连续进行随机突变，从而使得正向突变得到积累，增加有益突变的效率。易错PCR技术可以很好地应用于蛋白质的分子改造中。
技术实现思路
本专利技术提供了一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用，通过人工基因突变和大量筛选的方法，对篮状菌来源的酸性木聚糖酶(GenbankID：BAO51921.1)进行改良，筛选得到热稳定性提高的突变体，从而有利于提高其在饲料工业中的应用效果。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF01，其氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。本专利技术提供了一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF02，其氨基酸序列如SEQIDNO：5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。本专利技术提供了一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF03，其氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。本专利技术提供了一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF04，其氨基酸序列如SEQIDNO：9所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示。本专利技术提供了一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF05，其氨基酸序列如SEQIDNO：11所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。本专利技术还提供了包含所述木聚糖酶突变体编码基因的重组表达载体。本专利技术提供了包含所述木聚糖酶突变体编码基因的的基因工程菌，所述基因工程菌为毕赤酵母GS115和毕赤酵母X33。本专利技术提供了氨基酸序列如SEQNO：1所示的天然木聚糖酶XYNTF0在用于制备动物饲料添加剂中的应用。本专利技术提供了所述木聚糖酶突变体在用于制备动物饲料添加剂中的应用。所述动物为鸡、鸭、猪、牛、鱼。与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术以木聚糖酶XYNTF0为基础，提供了分别包含P84T的单点突变体XYNTF01，分别包含S14R/P84T、P84T/L121E的双位点突变体XYNTF02和XYNTF03，以及分别包含S14R/T55P/P84T、S14R/P84T/S200A的三位点突变体XYNTF04和XYNTF05。本专利技术改造后的突变体XYNTF01，XYNTF02，XYNTF03、XYNTF04和XYNTF05的酶活比原始酸性木聚糖酶分别提高了54.9％、97.1％、117.5％、146.0％和126.9％；同时在80℃处理3分钟时的热稳定性分别提高了38％、57％、39％、32％和71％。通过本专利技术技术方案得到的酸性木聚糖酶突变体的酶活力和热稳定性较野生型有较大提高，使其在食品、饲料添加、化工等领域有很好的应用潜力。附图说明图1为本专利技术中木聚糖酶蛋白电泳图(泳道：1，9为蛋白质Marker；2为XYNTF0重组菌株发酵液上清；3为XYNTF01重组菌株发酵液上清；4为XYNTF05重组菌株发酵液上清；5为XYNTF04重组菌株发酵液上清；6为XYNTF03重组菌株发酵液上清；7为XYNTF02重组菌株发酵液上清；8为未表达木聚糖酶的阴性对照；)；图2为本专利技术中木聚糖酶突变体平均酶活比较；图3为本专利技术中木聚糖酶突变体在80℃水浴3min耐热性比较；图4为本专利技术中木聚糖酶在30L发酵罐中的发酵数据。具体实施方式为了便于理解本专利技术，以下将结合较佳的实施例对本文专利技术做更全面、细致地描述，但本专利技术的保护范围并不限于以下具体实施例。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。1.菌株和载体毕赤酵母GS115，质粒pPIC9K，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21，质粒pET21a(+)购自Invitrogen公司。2.试剂与培养基质粒提取试剂盒，片段纯化回收试剂盒，限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；GeneMorphII随机突变PCR试剂盒购自Stratagene公司；氨苄青霉素，IPTG等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl；MD培养基：1.34％YNB，0.4mg/L生物素，2％葡萄糖；YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.4mg/L生物素，1％甘油；BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.4mg/L生物素，1％甲醇；BSM培养基：26.7mL85％的磷酸，0.93g二水硫酸钙，14.9g二水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，18.2g硫酸钾，40g甘油，4.0mlLPMT1。以上培养基为固体时加入2％的琼脂粉。3.实验方法菌株培养条件：大肠杆菌37℃培养，酵母30℃培养。液体培养时摇床转速为200rpm。毕赤酵母GS115转化方法：将活化的毕赤酵母GS115接种到含有20mLYPD液体培养基中，30℃摇瓶培养至OD600为1.2～1.5后低温离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF01，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
1.一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF01，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。2.一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF02，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO：5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。3.一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF03，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。4.一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF04，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO：9所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖志壮，薛海曌，
申请(专利权)人：青岛红樱桃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37