一种含低温葡萄糖氧化酶的饲料添加剂及其用途制造技术

本发明专利技术涉及畜禽养殖技术领域，特别涉及到一种含低温葡萄糖氧化酶的饲料抗菌添加剂及其用途。所述饲料添加剂包括葡萄糖氧化酶和二氧化硅，该葡萄糖氧化酶产自一种产葡萄糖氧化酶的柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)8‑Ⅲ菌株，保藏号为CGMCC NO.17228，具备低温酶特性。使用时，将所述抗菌饲料添加剂直接加入饲料中即可，在23℃条件储藏可降低饲料霉变率。本发明专利技术提供的抗菌饲料添加剂包括GOD具有安全性高、无耐药性的优点，调节肠道菌群平衡性，产生益于有益菌生长的环境，通过抑制动物肠道有害微生物的繁殖，进而促进动物生长、提高饲料转化效率、降低疾病的发生率，可以有效替代抗生素，符合健康养殖的发展方向，在饲料领域有良好的应用前景。

A Feed Additive Containing Low Temperature Glucose Oxidase and Its Application

The invention relates to the technical field of livestock and poultry breeding, in particular to a feed antimicrobial additive containing low temperature glucose oxidase and its use. The feed additive includes glucose oxidase and silicon dioxide. The glucose oxidase is produced by Citrobacter sp. 8_III strain, which produces glucose oxidase. The preservation number is CGMCC NO. 17228, and has the characteristics of low temperature enzyme. When used, the antimicrobial feed additive can be directly added to the feed, and the feed mildew rate can be reduced by storing at 23 ~C. The antimicrobial feed additive provided by the invention includes GOD, which has the advantages of high safety and non-drug resistance, adjusts the balance of intestinal flora, produces an environment beneficial to the growth of beneficial bacteria, promotes animal growth, improves feed conversion efficiency, and reduces the incidence of diseases by inhibiting the reproduction of harmful microorganisms in animal intestines, thus effectively replacing antibiotics and conforms to the development of healthy breeding. It has good application prospects in the field of feed.

【技术实现步骤摘要】
一种含低温葡萄糖氧化酶的饲料添加剂及其用途
本专利技术涉及畜禽养殖
，特别涉及到一种含低温葡萄糖氧化酶的饲料抗菌添加剂及其用途。
技术介绍
抗生素用于养殖业已经有近百年的历史了，其预防疾病和促进生长的功能得到广泛应用。全球超过90％的动物饲料中含有抗生素及其类似物成分，其中绝大多数用于促生长作用和提高饲料转化率。对于近现代养殖业，抗生索毫无疑问发挥着重要作用，体现出显著的经济效益。但随着研究的深入抗生素带来的问题也增多，抗生素不正确的使用方式会导致致病菌的抗性水平不断升高，目前耐药菌问题已经引起社会广泛关注。美国和日本陆续出台了畜禽养殖中限用和禁用抗生素的相关法规，我国作为养殖业大国，合理使用抗生素、寻找安全有效的抗生素代替物也成为我国高度重视的问题，近年来我国对饲料抗生素代替产品的研究也逐渐加快。葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖去除肠道内氧气,为厌氧有益菌双歧杆菌的增殖制造厌氧环境；生成的葡萄糖酸可降低胃肠内pH值为乳酸菌生长制造酸性环境。有益菌大量增殖形成微生态竞争优势,不利于大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌存活,控制感染,排除腐败物质,提高巨噬细胞活性,从而提高机体免疫力，可作为一种有效的抗生素代替品，其作用机理完全不同于抗生素,不会产生菌体抗药性或药物残留。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种含低温葡萄糖氧化酶饲料添加剂及其用途，旨在提供一种既能提高动物抗菌性且同时具备防腐功效的饲料添加剂。为实现上述目的，本专利技术提出一种饲料添加剂，由低温葡萄糖氧化酶和二氧化硅组成，所述的低温葡萄糖氧化酶产自一种产葡萄糖氧化酶的柠檬酸杆菌(Citrobactersp.)8-Ⅲ菌株，该菌株已于2019年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCCNO.17228。葡萄糖氧化酶的制备方法如下：步骤1、将保藏菌株以2％比例接种于LB液体培养基，20℃，160rpm培养48h。LB培养基：0.5-1％氯化钠、0.5-1％酵母提取物、0.5-1％蛋白胨；步骤2、取步骤1培养好的菌液200μL接种于100mL发酵培养基，20℃，160rpm培养48h。发酵培养基：4-6％葡萄糖、0.3-0.5％蛋白胨、0.2-0.4％磷酸二氢钾、0.05-0.1％硫酸镁、0.05-0.1％氯化钾、0.4-0.6％硝酸钠pH6.5。步骤3、将步骤2所得菌液与饱和硫酸铵溶液混合使硫酸铵饱和度达到75％，4℃静置12h。步骤4、将步骤3所得的菌液8000rpm离心15min，弃上清，以10mLpH7.4的PBS重悬沉淀。步骤5、将重悬液超声裂解15min(开3S，间隔5S，功率200W)，将裂解液10000r/min，4℃，离心20min，上清液为粗酶液。步骤6、粗酶液经G-100和Ni2+-NTA柱(Novagen)进行亲和层析纯化得到纯化后的葡萄糖氧化酶，洗脱的蛋白液4℃保存。步骤7、将步骤6中得到的纯化后的酶液置于冻干机中冷冻干燥，得到葡萄糖氧化酶酶粉。低温葡萄糖氧化酶与二氧化硅以4:1的比例复配。一种含低温葡萄糖氧化酶饲料添加剂的使用方法为：将所述其直接加入饲料中即可。所述饲料添加剂的添加量为所述动物饲料总质量的0.04％～0.05％。加入含低温葡萄糖氧化酶饲料添加剂的饲料低温葡萄糖氧化酶饲料在23℃条件储藏可降低饲料的霉变率。本专利技术提出一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包括低温葡萄糖氧化酶。以葡萄糖氧化酶作为抗菌饲料添加剂，具有以下优点：(1)可体内蛋白酶的作用下分解为基本氨基酸，对人类和动物体无任何副作用，对环境无作用或作用小；(2)不易或不诱发耐药菌产生，也不易诱发交叉耐药菌的产生，不会产生耐药性；(3)可以避免对饲料维生素、矿物质等营养物质的破坏，避免对饲料加工设备的酸腐蚀损坏；(4)葡萄糖氧化酶无不良气味和味道，不会影响饲料的适口性。(5)调节肠道菌群平衡性，产生益于有益菌生长的环境，通过抑制动物肠道有害微生物的繁殖，进而促进动物生长、提高饲料转化效率、降低疾病的发生率，可以有效替代抗生素，符合健康养殖的发展方向。与现有报道的抗生素代替品相比葡萄糖氧化酶本身具备脱氧防腐的功能，在饲料领域有良好的应用前景。具体实施方式本专利技术结合以下实施例进一步说明。实施例一一种含低温葡萄糖氧化酶的饲料抗菌添加剂的制备一种含低温葡萄糖氧化酶的饲料抗菌添加剂，由低温葡萄糖氧化酶和二氧化硅组成，所述的低温葡萄糖氧化酶产自一种产葡萄糖氧化酶的柠檬酸杆菌(Citrobactersp.)8-Ⅲ菌株，该菌株已于2019年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCCNO.17228。一、葡萄糖氧化酶的制备：步骤1、将实验室保藏菌株以2％比例接种于LB液体培养基，20℃，160rpm培养48h。LB培养基：1％氯化钠、0.5％酵母提取物、1％蛋白胨；步骤2、取步骤1培养好的菌液200μL接种于100mL发酵培养基，20℃，160rpm培养48h。发酵培养基：6％葡萄糖、0.3％蛋白胨、0.2％磷酸二氢钾、0.07％硫酸镁、0.05％氯化钾、0.4％硝酸钠pH6.5。步骤3、将步骤2所得菌液与饱和硫酸铵溶液混合使硫酸铵饱和度达到75％，4℃静置12h。步骤4、将步骤3所得的菌液8000rpm离心15min，弃上清，以10mLpH7.4的PBS重悬沉淀。步骤5、将重悬液超声裂解15min(开3S，间隔5S，功率200W)。将裂解液10000r/min，4℃，离心20min，上清液为粗酶液。步骤6、粗酶液经G-100和Ni2+-NTA柱(Novagen)进行亲和层析纯化得到纯化后的葡萄糖氧化酶，洗脱的蛋白液4℃保存。步骤7、将步骤6中得到的纯化后的酶液置于冻干机中冷冻干燥，得到葡萄糖氧化酶酶粉。二、低温葡萄糖氧化酶与二氧化硅以4:1的比例复配。实施例二饲料添加剂的抗菌性所述饲料添加剂由所述低温葡萄糖氧化酶与适当的载体复配后形成，所述载体为二氧化硅。这样可以避免所述低温葡萄糖氧化酶由于直接暴露于环境中或者在使用时与饲料中的其他成分接触而导致失活或者变性。所述饲料添加剂可以将其直接加入到动物饲料中饲喂动物，将所述饲料添加剂与动物饲料基础日粮均匀混合后用于饲喂动物，均可以通过被动物摄入体内而实现抗菌的功效，使用时，以所述饲料添加剂的添加量占动物饲料总质量的0.05％为准。在鸡饲料中以0.05％加入所示饲料添加剂(低温葡萄糖氧化酶与二氧化硅4:1混合)。以未添加的为对照组，实验组分为A、B和C三组，每组10雏鸡。饲养14天，记录数据如表1所示。表1雏鸡体重变化表项目对照组A组B组C组平均日增重(g/天)178.57±23.95285.57±26.49274.41±33.75289.38±29.06平均日摄入(g/天)580.62±39.77605.37±35.81588.83±40.05591.39±32.64腹泻率(％)8.26±1.443.95±1.082.63±1.643.72±0.97加入本专利技术饲料添加剂的实验组对比于对照组平均日增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含低温葡萄糖氧化酶的饲料添加剂，其特征在于，由低温葡萄糖氧化酶和二氧化硅组成，所述的低温葡萄糖氧化酶产自一种产葡萄糖氧化酶的柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)8‑Ⅲ菌株，该菌株已于2019年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCC NO.17228。

【技术特征摘要】
1.一种含低温葡萄糖氧化酶的饲料添加剂，其特征在于，由低温葡萄糖氧化酶和二氧化硅组成，所述的低温葡萄糖氧化酶产自一种产葡萄糖氧化酶的柠檬酸杆菌(Citrobactersp.)8-Ⅲ菌株，该菌株已于2019年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCCNO.17228。2.根据权利要求1所述的含低温葡萄糖氧化酶的饲料添加剂，其特征在于，所述的低温葡萄糖氧化酶的制备方法为：步骤1、将保藏菌株以2％比例接种于LB液体培养基，20℃，160rpm培养48h；步骤2、取步骤1培养好的菌液200μL接种于100mL发酵培养基，20℃，160rpm培养48h；步骤3、将步骤2所得菌液与饱和硫酸铵溶液混合使硫酸铵饱和度达到75％，4℃静置12h；步骤4、将步骤3所得的菌液8000rpm离心15min，弃上清，以10mLpH7.4的PBS重悬沉淀；步骤5、将重悬液超声裂解15min，开3S，间隔5S，功率200W；将裂解液10000r/...

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆芳，胡善松，迟乃玉，刘春莹，李美玉，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21