一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT，可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因，用于敲除该酵母MIG1基因，获得乳糖酶基因表达葡萄糖解阻遏菌株。可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因，用于敲除该酵母MIG1基因，获得乳糖酶基因表达葡萄糖解阻遏菌株，能够使许多蛋白基因的表达都会受到葡萄糖解阻遏作用，在有葡萄糖存在情况下有关蛋白质或酶产量会大幅度提高，特别是乳糖酶，可以利用高产乳糖酶酵母菌通过发酵生产乳糖酶，降低乳糖酶生产成本和应用乳糖酶的费用，提高含乳糖牛奶和奶制品处理效果，对增加人类食用牛奶和奶制品的营养，增强身体健康具有重要的实际意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体PMD19/HPT，属于生物

技术介绍
β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1. 23)，通常称为乳糖酶，可催化牛奶和奶制品中乳糖水解产生葡萄糖及半乳糖，并且具有半乳糖苷转移作用。乳糖酶在食品、医药、能源工业和畜牧业等领域的广泛应用，因而受到越来越多的关注。通过牛奶和奶制品中乳糖的水解增加这些食品的营养价值，解决乳糖不耐症食用牛奶和奶制品出现的问题，同时产乳糖酶的微生物可以用于处理乳清废水，减少环境污染。许多细菌、丝状真菌和酵母菌可以产生乳糖酶，其中克鲁氏酵母菌如马克斯克鲁氏酵母(Jluyveromyces marxianus),乳酸克鲁氏酵母{Kluyveromyces lac ti51)和极地耐冷酵母菌Guehomyces pullulans 17_I菌株产生的乳糖酶受到广泛重视。尤其马克斯克鲁氏酵母具有很强的同化乳糖和菊粉的能力、生长速率极快、代时短、生长时耐高温、具有很强的分泌胞外产物的能力和是被美国食品药物局确认为最安全的微生物，而在许多方面得到了广泛应用。但是所有产乳糖酶的微生物乳糖酶基因表达和合成乳糖酶时会受到培养基中的葡萄糖严重阻遏，由于工业用培养基和含乳糖培养基中存在有葡萄糖，所以葡萄糖阻遏会严重影响有关微生物的乳糖酶产量。在葡萄糖阻遏过程中一种叫做Migl蛋白起非常重要的作用，这种蛋白是一种带有C2H2的锌指蛋白，能结合在受葡萄糖阻遏的各种基因启动子上，被结合的基因启动子必须含有(G/C) (C/T)GGGG序列，在该序列的5端还得有富含AT的区域(AT_rich region)。现在发现Migl蛋白是细胞中具有广泛调控作用的一种蛋白质，只要这些蛋白基因启动子含有(G/C) (C/T)GGGG序列，这些蛋白基因的表达都会受到Migl蛋白的调控作用。所以该细胞中基因被敲除后，许多蛋白基因的表达都会受到葡萄糖解阻遏作用，在有葡萄糖存在情况下有关蛋白质或酶产量会大幅度提高。这样构建合适的敲除载体，敲除马克斯克鲁氏酵母#/似基因，对于提高该酵母菌的乳糖酶具有非常重要的生产实际意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体PMD19/HPT，可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母#/似基因，用于敲除该酵母基因，获得乳糖酶基因表达葡萄糖解阻遏菌株。本专利技术的技术解决方案如下构建了可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母基因的敲除载体PMD19-HPT，携带有潮霉素磷酸转移酶基因G7/T) 、用于同源重组的马克斯克鲁氏酵母基因启动子序列和终止子序列和用于删除逆Γ基因的Loxp片段(5’ -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT- 3’)，在逆Γ基因表达框上下游各加入一个LoxP位点，并使二者同向，可以利用Cre重组酶将///T基因表达框删除。在转化敲除载体进入产乳糖酶的马克斯克鲁氏酵母细胞之前，用DNA限制性内切酶通ο 酶切质粒？1 19-即1'，获得#见7基因启动子片段-///T基因-#Λ 7基因终止子片段；转化该片段到产乳糖酶的马克斯克鲁氏酵母细胞后，通过同源重组插入到正常的#/似基因中，利用基因取代基因ORF框，并可以稳定遗传；获得转化子之后，把质粒PKlNatCre (携带有酶切Loxp片段的酶基因)转化到转化子中，表达后删除规T基因，获得无规T基因和MIGl基因的敲除菌株。本专利技术公开的一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体PMD19/HPT，其碱基序列见如SEQ No.1所示。该载体大小为4137 bp。本专利技术提供的一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT制备方法如下 (I) PCR产物的扩增 MIGl基因的启动子用5'端带有ZAoI酶切位点的引物Hl和与克隆基因的特殊引物H3有共同序列的引物H2以尤marxianus的基因组DNA为模板进行PCR扩增，引物Hl和H2是根据尤基因序列设计的。引物Η3和Η4是根据质粒pCAMBIA 1381上规T基因序列设计的，利用这对引物通过PCR技术扩增规T基因(1026 bp)部分。MIGl基因的终止子由引物H5和H6以尤marxianus的基因组DNA为模板进行PCR扩增得到，弓丨物H6的5'端带有XhoI酶切位点，引物H5和克隆逆Γ基因的特殊弓丨物H4有共同序列，弓I物H5和H6也是根据尤marxianus MIGl基因设计的。PCR扩增体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT，碱基序列见如SEQ?No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体PMD19/HPT，碱基序列见如SEQ No.1所示。2.权利要求1所述的乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体PMD19/HPT制备方法，包括以下步骤 将扩增的PCR产物与载体pMD19-T Simple的连接；连接产物pMD19/HPT转化E. ColiDm α感受态细胞； 质粒的提取、酶切及回收用于转化酵母的线性DNA片段 利用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒提取过程按照试剂盒说明进行；用％01酶切PMD19/HPT 质粒；37°C酶切 4 h 后，加入 2. O μ ΙΟX loading buffer 终止反应，并用 O. 8%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段； 转化与筛选 (1)取80.O μ L的尤marXianus感受态细胞,加入浓缩并除...

【专利技术属性】
技术研发人员：池振明，池哲，周海翔，徐金利，李慧娟，
申请(专利权)人：吉林巨润生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：