双顺反子共表达基因转移体及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种双顺反子共表达基因转移体及制备方法，基因转移体的基因序列为：SEQ?ID?No.15，该基因转移体的5＇端起到3＇端止依次包括有牛核基质结合区MAR、人工构建的组合启动子CAG、抑制蛋白基因FSTN、内部核糖体进入位点IRES、绿色荧光蛋白AcGFP基因、Rabbit?globin?polyA信号区；该制备方法包括：构建载体pCAG-IRES2-AcGFP1；FSTN基因的获得和插入pCAG-IRES2-AcGFP1载体；MAR序列的获得和插入pCAG-IRES2-AcGFP1载体；质粒载体构建及获得双顺反子共表达基因转移体。本发明专利技术的基因转移体不仅是洁净的、安全的基因转移体，而且实现了任意组合的双基因共表达，通过IRES的重复利用，实现多基因共表达的目的，为改善双、多基因控制的形状如经济性状提供新的思路和途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
中的基因工程技术，具体涉及一种双顺反子共表达基因转移体的制备方法。
技术介绍
在转基因动物中 外源基因的高效表达必须依赖好的表达载体。影响外源基因高效表达的因素很多，如启动子、甲基化、基因本身结构、插入位点、调控序列(增强子、绝缘子、核基质结合区)等。CAG启动子是人工构建的组合启动子，由巨细胞病毒(the cytomegalovirus,CMV)早期增强子(early enhancer element)和鸡 P -肌动蛋白(chicken beta-actin)启动子组成，CAG启动子是非特异性的组成型启动子，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达。CMV是常用的启动子，在我们转基因羊的应用中，发现在转基因个体中发生甲基化，导致转基因的沉默。核基质结合区(MARs)是真核生物染色质中与核基质或核骨架特异结合的一段DNA序列。MARs参与DNA复制调控和转录调控等多种核生化过程。MA Rs的长度一般为300 — IOOObp，也有的长达几个kb，维持其活性的最小长度约是300bp，MARs是非编码序列，AT含量高达70%，不同的MARs序列不同，但往往含有相似的结构基元，如烟草中发现TM2序列具备一般MARs序列的基本特征其序列全长lOOlbp，AT含量为62. 8%，序列上含有一个典型的T-box，两个潜在的DNA解旋序列(AATATT)和一个潜在的拓扑异构酶II结合位点(CTTTATATTGTTGAC)。研究表明,MARs序列的功能包括边界因子(boundarye Iement)作用、染色质调节作用、DNA复制起始子的组分、染色体结构组成作用、MARS对转基因表达的调控作用，鉴于MARs与基因表达间的关系，尤其它能显著地增强转基因表达、克服位置效应、消除转基因沉默，它已被作为一种顺式调控元件应用到转基因技术中。FSTN，全称叫卵泡抑素(Follistatin，FST)又名FSH抑制蛋白，是一种单链糖蛋白，最初是从牛和猪的卵泡液中分离出来的，因而被称作卵泡抑制素。以旁分泌或自分泌的方式，与转化生长因子-P (TGF-P)超家族的许多成员，如骨形态发生蛋白(BMP)、肌肉抑素(MSTN)等结合，其中MSTN是目前所知的最强的骨骼肌生长抑制物。FST蛋白能够同MSTN黏合在一起，阻断其抑制功能，从而促进肌肉的生长。IRES序列，内部核糖体进入位点序列，真核生物大多数蛋白质合成采用了依赖帽子结构的翻译起始方式.但一组缺乏帽子结构的RNA病毒的蛋白质合成起始是依赖其5'端非翻译区(untranslated region, UTR),即内部核糖体进入位点(IRES),该位点是一段高度保守序列，可使其前后基因在同一启动子下转录一个双顺反子mRNA，而转译时使两基因分别翻译成两个独立的产物。因此，在真核生物转基因表达载体构建中，常用于构建在一个启动子下IRES连接两个基因编码序列，实现双顺反子共表达。能实现双顺反子共表达的还有I) Fusion基因融合2) cis trans Proteas顺反蛋白酶3) Reintiation再开始4)Splicing剪接(基因之间设计酶切位点5).1nternal Promoter中间启动子6)手足病病毒2A等。近年来利用去除质粒载体主干序列的基因表达盒(仅包括启动子、编码区和终止子)作为基因转移体，也称为洁净D N A转化(c I eanDNAt rans f ormat i O n)，主要是通过基因枪转化植物，已在水稻、棉花、小麦、葡萄转化中获得成功应用，利用花粉管导入法在甜瓜中也成功利用，很少见在转基因动物尤其哺乳动物中的构建与应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种双顺反子共表达基因转移体的制备方法，提供能使两种目的基因作为双顺反子高效共表达，无质粒载体主干序列、无抗性等选择标记、为洁净和安全性的双顺反子共表达基因转移体。本专利技术解决其技术问题是采取以下技术方案实现的一种双顺反子共表达基因转移体，基因转移体的基因序列为SEQ ID NO :15。而且，所述基因转移体从5 '端起到3'端止依次包括有牛核基质结合区MAR、人工构建的组合启动子CAG、抑制蛋白基因FSTN、内部核糖体进入位点IRES、绿色荧光蛋白AcGFP 基因、Rabbit globin polyA 信号区。而且，所述核基质结合区MAR的序列通过如下引物进行PCR获得CAG 前的 MAR 序列CMAFl 正义链，5 ;到 3 ' SEQ ID No. 9 ；CMAR2 反义链，5 ;到 3 ' SEQ ID No. 10 ；PolyA 后的 MAR 序列PMFl 正义链，5 ;到 3 ' SEQ ID No. 11 ；PMR2 反义链，5 ;到 3 ' SEQ ID No. 12。而且,所述核基质结合区MAR的序列为SEQ ID No. 13。而且，所述抑制蛋白基因FSTN的序列通过如下引物进行PCR获得FMFl 正义链，5 ;到 3 ' SEQ ID No. 7 ；FMR2 反义链，5 ;到 3 ' SEQ ID No. 8。而且，所述抑制蛋白基因FSTN的序列为SEQ ID No. 14。一种双顺反子共表达基因转移体的制备方法，步骤如下第一步，由pCAGEN载体上的CAG启动子移植并替换pCMV-1RES2_AcGFPl，中的CMV,同时以 pCAGEN 载体上 Rabbit globin polyA 移植并替换 pCMV_IRES2_AcGFPl 中的SV40polyA,构建载体 pCAG-1RES2-AcGFPl ；第二步，FSTN外源基因的获得和插入pCAG-1RES2_AcGFPl载体；第三步，MAR序列的获得和插入pCAG-1RES2_AcGFPl载体；第四步，质粒载体pMAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-polyA-MAR 构建完毕后，用 Sac1 、Afl II双酶切，获得MAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-polyA-MAR双顺反子共表达基因转移体。而且，所述步骤第一步，进一步的具体步骤包括⑴插入T片段，改变酶切位点从PMD19T-simple vector上获得T片段，通过酶切位点将该片段连入载体，改变载体上原有酶切位点的顺序；(2) CAG启动子的插入将CAG启动子从pCAGEN载体上切下，连入到上述载体中；⑶Rabbit globin polyA的获得和插入从pCAGEN载体上获得Rabbitglobin polyA序列，通过两个酶切位点将获得的Rabbit globin polyA序列插入到载体pIRES2-AcGFPl 中；(4) CMV启动子的切除将CMV启动子从载体pIRES2_AcGFPl上切除；(5)补齐pUC后半段根据pUC的基因序列设计引物，通过PCR反应获得pUC序列的后半段，通过两0000000000个酶切位点将获得的片段连入到载体PIRES2-ACGFP中，至此，载体pCAG-1RES2-AcGFPl构建完毕。 而且，所述步骤第二步，进一步的具体步骤包括⑴依据FSTNcDNA基因序列设计引物；⑵通过PCR反应获得FSTN的全长片断；⑶测序通过胶回收的方法回收该片段,本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：基因转移体的基因序列为：SEQ?ID?No.15。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李光鹏，胡晓明，于超然，杨磊，谌颜，扈廷茂，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：