本发明专利技术公开一种锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白１及其单克隆抗体和应用，该锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白１的氨基酸序列如ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：３所示，其核苷酸序列如ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：１所示。本发明专利技术通过对ＭＣＤＶ进行研究分析，首次获得其结构蛋白１的氨基酸序列、核苷酸序列和单克隆抗体，并对该结构蛋白１进行了定位，为锯缘青蟹的病毒病研究提供了新的研究方向。本发明专利技术筛选到结构蛋白１的单克隆抗体可用于ＭＣＤＶ的监控，制备检测ＭＣＤＶ的病毒试剂盒，以及制备检测ＭＣＤＶ的病毒胶体金试纸。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及青蟹养殖生物
，尤其涉及锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1及其单克隆抗体和应用。
技术介绍
锯缘青蟹(Scylla serrata，学名为Mud crab)，俗称青蟹，主要分布于印度洋-太平洋的热带、亚热带海域，是经济价值很高的食用蟹类，为名优养殖品种之一。 病毒病是锯缘青蟹养殖过程中的主要病原，其造成青蟹养殖业的严重经济损失，因此锯缘青蟹养殖过程中，对各类病毒病的研究是当前的重要课题。 2004年始在珠海发现患"嗜睡病"(SD)的锯缘青蟹同时存在两种病毒锯缘青蟹 双顺反子病毒(Mud crab dicistrivirus，MCDV)禾口呼肠孤病毒(mudcrab reovirus，MCRV)。 MCDV是水生甲壳动物中发现的单股正链RNA病毒ssRNA(+)，其单独存在就可以使 锯缘青蟹致病，而且死亡率可达80%以上，因此对MCDV的感染机制和致病性进行研究，在 青蟹养殖业中及时监测MCDV的发病情况，寻找有效的预防和防治方法，是当前锯缘青蟹养 殖需要解决的重要问题。 双顺反子病毒(dicistrivirus)是一个新分类的病毒属，随着海洋病毒学的不断 深入，越来越多的水生生物的双顺反子病毒被发现，但是其结构蛋白还未见研究，有关锯缘 青蟹双顺反子病毒(MCDV)的结构蛋白的研究也未见有相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种锯缘青蟹双顺反子病毒的结构 蛋白1。 本专利技术的另一个目的在于提供上述锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1的单克隆 抗体。 本专利技术的另一个目的在于提供上述单克隆抗体在制备检测MCDV病毒试剂盒或胶 体金试纸中的应用。 本专利技术的上述目的是通过如下方案予以实现的 本专利技术人从同时存在于锯缘青蟹的两种病毒(MCDV和MCRV)中分离纯化出MCDV， 电镜观察发现其直径为20 30nm，球形，无囊膜，呈二十面体对称，在CsCl中的浮力密度为 1. 32 1. 36g/cm3，核酸性质分析发现此病毒基因组为单股正链RNA病毒ssRNA(+)。 本专利技术人对MCDV的基因组分析发现其包含有被基因间非编码区(IGR)隔开的两 个开放读码框0RF1和0RF2，其中，0RF1编码非结构蛋白，0RF2编码结构蛋白。 本专利技术人对0RF2进行进一步地研究发现，0RF2由三个结构蛋白组成，分别是分子 量为53KD的结构蛋白1 (简称VP1)、分子量为35KD的结构蛋白2 (简称VP2)和分子量为 22KD的结构蛋白3 (简称VP3)。 接着，本专利技术人对结构蛋白1进行了一系列的研究分析，如下所示 1 、氨基酸序列及其编码核苷酸序列 结构蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示； 编码结构蛋白1的核苷酸序列，如SEQ ID NO :1所示。 2、单克隆抗体的获得 本专利技术人首先采用全病毒(MCDV)作为抗原，进行体内免疫试验，然后采用HAT与 HT选择杂交瘤细胞、间接ELISA法筛选阳性单克隆抗体，接着利用Western blot方法从阳 性单克隆抗体中将结构蛋白1的单克隆抗体筛选出来，最终获得能识别MCDV结构蛋白1的 单克隆抗体。 3、结构蛋白1的定位 本专利技术人在MCDV病毒分离纯化的基础上，对其三个结构蛋白的N端氨基酸进行了 测序，并与MCDV的基因组序列对比和结构分析，在MCDV基因组中找到了三个结构蛋白的相 应位置。 为了进一步对结构蛋白1精确定位，本专利技术人采用免疫电镜方法，观察上述 Western blot结果中，结构蛋白1的单克隆抗体所识别的抗原决定簇的位置，电镜结果显 示，该抗原决定簇定位于病毒粒子的边缘，从而实现了对MCDV结构蛋白1的精确定位。 本专利技术筛选到的MCDV结构蛋白1的单克隆抗体可用于MCDV的感染机制和致病性 研究，用于青蟹养殖业中及时监测MCDV的发病情况，用于锯缘青蟹双顺反子病毒(MCDV)活 体的中和作用，以及用于制备体外检测样品中是否存在MCDV病毒的试剂盒或胶体金试纸 条。 与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果 1.本专利技术通过对MCDV进行研究分析，首次获得其结构蛋白1的氨基酸序列、核苷 酸序列和单克隆抗体，并对该结构蛋白1进行了定位，为锯缘青蟹的病毒病研究提供了新 的研究方向； 2.本专利技术筛选到结构蛋白1的单克隆抗体可用于MCDV监控和检测的多个方面。 附图说明 图1为实施例1中纯化MCDV的SDS-PAGE电泳图； 其中，M为蛋白marker, 1 5为纯化的MCDV粒子，6为53KD的MCDV-VP1 ， 7为35KD 的MCDV-VP2， 8为22KD的MCDV-VP3 ; 图2为实施例3中抗体识别蛋白的Western-blot鉴定电泳图； 其中，1 5为识别MCDV-VP1的阳性单克隆抗体，M为蛋白marker,箭头所指为53KD的MCDV-VP1 ; 图3为实施例3筛选的识别MCDV-VP1的阳性单克隆抗体间接免疫电镜图； 图4为实施例3筛选的识别MCDV-VP1的阳性单克隆抗体间接免疫电镜图； 图5为实施例4中阴性对照免疫电镜图。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步地描述，但具体实施例并不对本专利技术做任 何限定。 实施例1MCDV结构蛋白1的获得 本实施例通过对MCDV纯化、N端测序与分析，得到结构蛋白1的氨基酸序列和核 苷酸序列，并对结构蛋白1进行生物学分析，预测其理化性质及保守功能结构域，为MCDV结 构蛋白的功能研究奠定基础，其具体步骤如下所示。 1. MCDV的纯化 (1)称量病蟹的鳃样品约15g，液氮下迅速研磨至粉末状； (2)将研好的粉末倒入250ml离心管中，按20倍体积的量加入PBS，匀浆； (3)将匀浆后的病毒液4。C离心除渣1000rpm离心20min ;转向后3000rpm离心 3min ;上清转入新管，平衡后，12000 15000rpm高速离心1小时； (4)收集上述离心上清液，再次44000rpm(200000 Xg)离心2小时或者33000rpm(150000Xg)离心7 10小时，沉淀病毒; (5)将沉淀的病毒粒子中加入0. 5ml PBS分散过夜； (6)制备CsCl密度梯度分别用质量百分比浓度为15%、25%、35%和45%的 CsCl溶液先轻后重依次加入SW41透明离心管中； (7)将分散过夜的病毒粒子加入CsCl梯度的最上层，35000rpm超速离心10小时 左右； (8)吸出病毒条带，在35质量X蔗糖垫上，用PBS洗涤，35000rpm超速离心2小 时； (9)初步纯化的每条带的病毒液分别上第二次CsCl梯度，重复步骤(7)， (S)，所述 CsCl梯度同步骤(6); (10)收集纯化病毒液，取其中5 10 ill fC保存，以备及时测定病毒浓度和电镜 观察，其余-S(TC保存备用。 2.纯化MCDV的浓度测定、电镜观察和SDS-PAGE鉴定 取2 5 iU上述新鲜纯化的病毒液，用紫外分光光度计粗略测定病毒浓度，结果 为2. 56ii g/iU。 取5iU病毒悬液滴到喷有碳粉的铜网上，吸附lmin，用滤纸吸干悬液；然后，用 2%的磷钨酸溶液染色40秒，再用滤纸吸去多余染液；灯照烘干，用Philips-CMIO透射电子 显微本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白１，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张锐，翁少萍，何建国，区宇洁，董传甫，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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