抗体的多顺反子表达制造技术

此处描述的是一个新型的表达系统，用以从一个单一多顺反子构建体中产生目的多基因产物。尤其是，该表达系统包含一个多顺反子载体，能够在真核宿主细胞中表达功能抗体，其中载体在５′－３′方向上至少包含下面的可操作连接的元件：在真核细胞可操作的启动子；编码至少抗体轻链可变区的ＤＮＡ序列；内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）；以及至少一个编码抗体重链的ＤＮＡ序列。也公开了包含多顺反子表达载体的哺乳动物细胞，和一种在用多顺反子表达载体转染的哺乳动物细胞中产生功能抗体的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新型多顺反子表达系统和方法，用于使用这种表达系统在真核细胞中生产抗体。更具体地，本专利技术涉及真核多顺反子表达系统，其中抗体重链和轻链基因从相同的启动子转录，并且，更优选地，抗体重链和轻链基因被一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)隔开。
技术介绍
采用多顺反子表达载体在重组宿主细胞中表达所选基因的方法是众所周知的。在历史上，这样的多顺反子表达载体已经被使用，包括一个在转录区5’末端的目的产物基因序列和一个3’选择标记基因序列。这样的载体显示了3’选择基因的低效翻译，而优先地翻译在多顺反子mRNA的5’末端的目的基因序列。表达高水平的目的基因产物的重组宿主细胞通过一个单一步骤的方法获得，该方法包括在选择性培养基中培养原始转染体。这样的载体的一个缺点是上游阅读框架可能对选择标记基因的翻译施加不可预知的影响。参见Kaufman，Meth.Enzymol.，185487(1990)。例如，颁给Levinson等的美国专利第4,713,339号(在字面上转让给Genentech，Inc.)公开了一个能够在真核宿主细胞中生产目的基因产物的多顺反子表达系统。在这个Levinson等拥有专利的系统中，第二顺反子的基因序列编码了一个蛋白质，该蛋白质提供转染体或转化体的检测，该转染体或转化体表达由第一个顺反子编码的目的基因。某些生长条件在宿主细胞中诱导检测子基因的扩大表达，因而增强了编码包含在多顺反子转录单位中目的基因相关序列的表达。尤其是，Levinson构建了包含多顺反子的载体，其中编码乙型肝炎表面抗原的序列位于编码筛选标记二氢叶酸还原酶的上游。由于在Levinson的载体中的多顺反子的安排，同第一顺反子序列的表达相比，第二顺反子的下游标记基因序列存在不平衡表达。另外，多顺反子表达系统已经被用来表达多链多肽。例如，在颁给Dirks等的美国专利第6,060,273号；颁给Bublot的美国专利第6,033670；颁给Selby的美国专利第6,096,505号；颁给Marasco等的美国专利第6,143,520；颁给Audonnet等的美国专利第6,153,199号；颁给Johnston等的美国专利第6,156,558号中报告的多链多肽的多顺反子表达。研究者已经确定，通过在多顺反子内基因间加入内部核糖体进入位点，多顺反子中第二基因的水平被提高。IRES元件，最初在细小核糖核酸病毒中鉴定，通过直接招募和结合核糖体到信息上来调控翻译的起始，回避了参与典型的核糖体搜索中的7-甲基鸟苷帽。IRES序列的存在可以提高不依赖帽的目的蛋白的翻译。早期出版物说明地称IRES序列为“翻译增强子”。例如，心病毒RNA“翻译增强子”在颁给Palmenberg等的美国专利第4,937,190号和颁给Boris-Lawrie的美国专利第5,770,428号中描述。一些包含报告顺反子的IRES已经取得专利，如XIAPIRES(颁给Korneluk的美国专利第6,171,821和6,159,709号)。一个在多顺反子表达载体中具有已知用途的IRES序列是属于疱疹病毒；其它病毒也可以使用(参见美国专利6,193,980)。Korneluk公开这样构建的双顺反子载体，通过在具有CMV启动子的质粒中插入β-半乳糖糖苷酶和氯霉素乙酰转移酶报告序列，这样两个顺反子被一个100bp的包含IRES序列的顺反子间连接区域分隔。编码β-半乳糖糖苷酶的第一顺反子通过常规的依赖帽的机制翻译。编码氯霉素乙酰转移酶的第二顺反子只在前面的连接区域包含IRES位点时翻译。因此，Korne1uk表明IRES序列可以调控在双顺反子mRNA构建体中第二开放阅读框架的翻译，该mRNA构建体意在测定对压力的细胞反应。然而，只有标记序列被用在第二顺反子中，因为技术发展水平认识到在双顺反子安排中和第二序列表达相关的低效率。另外，采用多顺反子表达系统的可扩增标记的共表达已经被描述。例如，WO92/17566公开了一种用内含子修饰的选择基因和编码目的蛋白基因共转染宿主细胞的方法。内含子修饰的基因通过在一个选择基因的转录区域内插入一个内含子产生，这样内含子以降低的效率从mRNA上正确剪接下来。和未修饰选择基因序列相比，这种性质的低效率剪接导致低量的选择标记蛋白从内含子修饰选择基因上产生。尽管数量减少的选择基因和目的蛋白质同时产生时，这种模型并不在选择基因序列和目的基因序列间采用转录连接，因为这两个序列被不同的启动子驱动。使用双顺反子表达载体的抗体生产已经被公开，采用在二氢叶酸还原酶(DHFR)和编码目的抗体产物的核酸序列间具有转录连接的载体。参见颁给Crowley的美国专利5,561,053。Crowley的方法使用具有单一启动子的DNA构建体驱动选择标记序列和编码目的蛋白质的单一序列的表达。目的抗体的重链插入选择基因DHFR的下游，DHFR放置于DNA构建体5’末端的内含子内。内含子位于巨细胞病毒即早期启动子(CMV)和编码抗体重链序列之间。抗体轻链放置入第二载体，第二载体这样构建，放置轻链序列在SV40启动子/增强子的控制下并且可选择的潮霉素B抗性基因序列被CMV启动子/增强子和SV40 poly-A驱动。包含轻链和重链序列的载体线性化并且共转染入宿主细胞用以表达并且随后在轻链和重链间二硫键连接。因此，为了根据Crowley获得完整的抗体结构，两个载体必须被构建以分别表达抗体的重链和轻链组分。由于使用多载体，这个方法是低效的。Crowley的方法例证了与传统的多顺反子相关的位置效应引起的多个亚基的蛋白质表达的局限性。在多顺反子中5’和3’基因间表达的不平衡降低了用它来产生商业规模产量的多链蛋白质或相似目的产物的效率。颁给Dirks的美国专利第6,060,273号公开了这样的多顺反子表达单位，该多顺反子表达单位允许位于相应顺反子的基因的等摩尔表达。根据Dirks，可构建双顺反子表达载体以在IRES的帮助下表达两个目的基因，如PDGF-A和PDGF-B。在双顺反子表达载体中，增强第二顺反子表达的非洲爪蟾(Xenopus laevis)5’UTRβ-球蛋白序列帮助依赖IRES的翻译，这样达到顺反子1和2的等摩尔表达。双顺反子载体可以安排如下启动子-第一顺反子-IRES-β-球蛋白序列-第二顺反子。尽管Dirks的教导暗示了克服和一些多链蛋白质亚基多顺反子表达相关的低效率的方法，但本领域技术人员不认为其是一个令人满意的下游顺反子表达的不可预知性的解决方案。Mizuguchi等(IRES-dependent second gene expression is significantly lowerthan cap-dependent first gene expression in a bicistronic vector.Mol.Therapy，1(4)376-382(April，2000)研究了与几个培养细胞系的体外以及小鼠肝中的体内依赖帽的第一基因表达相比的依赖IRES的第二基因表达的效率。依赖IRES的第二基因表达是第一基因表达的6-100％，取决于在载体构建体种采用何种细胞类型和报告基因。另外，在双顺反子载体中何种基因位于第一的选择影响位于下游基因的表达。而且，本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在真核宿主细胞中表达功能抗体的多顺反子载体，该载体包括多顺反子转录系统，该多顺反子转录系统包括下面的在５’－３’方向上有效地连接的元件：（ｉ）在真核细胞中有效的启动子；（ｉｉ）包含编码抗体轻链的第一ＤＮＡ序列的第一顺反子，该第一ＤＮＡ序列可选择地在它的５’末端包含在真核细胞中有效的信号肽编码序列，其中所述的第一ＤＮＡ序列在它的３’末端不包括ｐｏｌｙＡ序列，并且其中所述的第一ＤＮＡ序列包含５’起始密码子和３’末端终止密码子；（ｉｉｉ）从选自心病毒、疱疹病毒和脊髓灰质炎病毒之一的成员获得的内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）；和（ｉｖ）至少一个第二顺反子，该第二顺反子包含下面的元件：（ａ）编码抗体重链的第二ＤＮＡ序列，其中所述的第二ＤＮＡ可选择地在它的５’末端包含在真核细胞中有效的信号肽编码序列，并且其中所述的第二ＤＮＡ序列只在该ＤＮＡ序列是多顺反子中最３’端编码序列时，在它的３’末端包含ｐｏｌｙＡ序列，并且进一步分别在所述的第二ＤＮＡ序列的５’和３’末端包含起始和终止密码子；其中在包含多顺反子载体的真核宿主细胞中，第一ＤＮＡ序列以相对第二ＤＮＡ序列１０∶１－１∶１的比例被表达。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M里夫，R巴尼特，
申请(专利权)人：拜奥根IDEC公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]