本发明专利技术公开了一种青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，引物组由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ?ID?NO.1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ?ID?NO.2所示，所述的Taqman探针的碱基序列如序列表中SEQ?ID?NO.3所示，在所述的Taqman探针的5′端标记有FAM为荧光发射基团，3′端标记有TAMRA荧光淬灭基团，所述的Taqman探针位于所述上游引物和下游引物之间。还公开了采用该引物组和探针的检测青蟹双顺反子病毒-1的方法和试剂盒，该方法成本低、耗时短、产率高，特异性高，且阴阳性结果差异显著，验证率高，更加明显可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法及其引物组、探针和试剂盒。
技术介绍
拟穴青蟹(Scylla paramamosain)(原被鉴定为拟穴青蟹(Scylla serrata)因肉质鲜美、生长迅速、分布广泛，是我国海洋渔业重要的养殖品种。但随着养殖规模的逐步扩大，病害问题也不断严重。青蟹双顺反子病毒_1 (Mud Crab Dicistrovirus-l,MCDV_l)是在近几年发病的青蟹中新发现的一种病原体。感染MCDV-1的拟穴青蟹体色没有明显变化，食欲不振，活动乏力，即使白天也不会潜入沙中，人工感染死亡率达100%。该病毒属于单正链RNA，双顺反子病毒科，能通过浸泡、禁食浸泡、投喂、共居的方式感染拟穴青蟹。到目前为止，对于MCDV-1感染还没有有效的治疗方法，杜绝传染源、防止病毒的传染和流行是能够采取的主要措施，早期快速诊断青蟹双顺反子病毒-1是减少损失的有效途径。因此，简便快速、特异性好、灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法对于疾病的预防具有重要意义。实时突光定量Real time-PCR(Real time fluorescent quantitativepolymerase chain reaction, Rea-1 time PCR),是指预先在 RT-PCR 反应体系中加入突光基团，可以是荧光染料，也可以是特异性标记的荧光探针，利用相应软件实时监测整个PCR进程中的荧光信号积累情况，最后通过建立标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其中Taqman探针技术是以Taqman突光探针为基础，Taqman突光探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，荧光监测系统从而可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与RT-PCR产物形成完全同步，从而实现定量。实时荧光定量RT-PCR方法实时检测、速度快、高通量、定量准确、灵敏度高、特异性好、自动化程度高，在病原微生物检测方面已得到广泛应用。该技术应用于病毒检测中，不仅可以对病毒定性，还能准确定量病毒核酸，使研究病毒载量的变化规律成为可能，并可对抗病毒治疗和药物筛选做出评估，为相关研究工作提供了有效的技术平台。目前尚无青蟹双顺反子病毒-1荧光定量PCR用于检测的相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，该引物组和探针对青蟹双顺反子病毒-1具有高特异性，可用于实时荧光定量RT-PCR技术检测青蟹双顺反子病毒-1。本专利技术所要解 决的第二个技术问题是提供一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，该方法快速、高效，特异性高。本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。本专利技术所要解决的第四个技术问题是提供上述青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针在检测青蟹双顺反子病毒_1中应用。本专利技术所要解决的第五个技术问题是提供上述对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒在检测青蟹双顺反子病毒-1中的应用。本专利技术所要解决的第一个技术问题是通过如下技术方案来实现的:一种青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，所述引物组由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的喊基序列如序列表中SEQ ID N0.1所不，所述的下游引物的喊基序列如序列表中SEQ ID N0.2所示,所述的Taqman探针的碱基序列如序列表中SEQ ID N0.3所示,在所述的Taqman探针的5'端标记有FAM为荧光发射基团，3'端标记有TAMRA荧光淬灭基团，所述的Taqman探针位于所述上游引物和下游引物之间。本专利技术所要解决的第二个技术问题是通过如下技术方案来实现的:一种检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法，利用上述的引物组和Taqman探针通过荧光定量RT-PCR反应对青蟹双顺反子病毒-1进行定性和定量检测。该方法具体包括以下步骤:一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，包括待测病毒RNA的提取及其cDNA的合成，在Taqman荧光定量RT-PCR反应体系进行Taqman突光定量RT-PCR反应，通过标准品的制备及标准曲线的建立,计算得出待测结果，Taqman荧光定量RT-PCR反应体系中含有上述引物组和Taqman探针，可以通过荧光定量RT-PCR反应对青蟹双顺反子病毒-1进行定性和定量检测。作为本专利技术的一种具体实施方式，本专利技术所述引物组中上游引物和下游引物的摩尔浓度优选为0.4 μ mol/L , Taqman探针的摩尔浓度优选为0.2 μ mol/L。本专利技术对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，具体含以下步骤:(I)选择MCDV-1基因的一段100 200bp长度的保守片段，利用primerpremier5.0软件设计病毒特异性定量PCR引物对和探针，扩增片段大小为119bp，引物对和探针序列为:上游引物Dic-taqF:5' -ACGAAGAATCTATCACTGGAATTGAA-3'；下游引物Dic-taqR:5' -CGTCTGCTTCCCGGGTTT-3'；Taqman 探针:5' -FAM-AATGCTCTGAACCGGAGTACGTCTGCC-TAMRA-3'，其中 FAM 为荧光发射基团，TAMRA为荧光淬灭基团。(2)构建和制备重组质粒标准品pMD 18-T-dic以上、下游引物进行常规PCR获得目的片段，利用DNA重组技术将包含目的片段的基因克隆到质粒载体pMD 18-T中，构建重组质粒pMD β 18-T-dic作为建立荧光定量PCR标准曲线的阳性标准品。(3)待测样本总RNA的提取和逆转录反应，获得样本cDNA。(4) MCDV-1荧光定量PCR检测方法的优化和建立经过对反应条件的优化，对建立的方法进行灵敏度、稳定性、特异性以及对临床标本的有效性进行综合评价。本专利技术所要解决的第三个技术问题是通过如下技术方案来实现的:一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，含有上述的Taqman探针和引物组。作为本专利技术的一种具体实施方式，本专利技术上述试剂盒中还可以含有荧光定量Realtime-PCR探针法反应预混液、阳性标准品(即含有目的片段基因的质粒)和无RNase水等。其中荧光定量PCR探针法反应预混液优选为iQTM Supermix(2x)，购自美国BIO-RAD公司，iQTM Supermix配方如下:2X反应缓冲液(含dNTPs)、iTaq DNA聚合酶、6mM MgCl2和稳定齐U，阳性标准品的质粒浓度优选为IO8Copies/ μ L。该试剂盒在使用时，先提取待测样品RNA反转录得到cDNA，然后用上述青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和探针进行荧光定量PCR反应，反应结果判定:I)若Ct值>35，且未出现标准扩增曲线，试验结果本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种青蟹双顺反子病毒?1检测用引物组和Taqman探针，其特征在于：所述引物组由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ?ID?NO.1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ?ID?NO.2所示；所述的Taqman探针的碱基序列如序列表中SEQ?ID?NO.3所示；所述的Taqman探针位于所述上游引物和下游引物之间；在所述的Taqman探针的5′端标记有FAM荧光发射基团，3′端标记有TAMRA荧光淬灭基团。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭志勋，张迪，马红玲，冯娟，苏友禄，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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