本发明专利技术公开了一种用于检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的引物组，包括呼肠孤病毒正向引物ReoF、呼肠孤病毒反向引物ReoR，双顺反子病毒正向引物DicF和双顺反子病毒反向引物DicR，各引物具体如下：ReoF：5-ACTCATAGAGCAGTCATGGG-3ReoR：5-ATATCGTCAGAATGTCGTTC-3DicF：5-GGATACTATGGATGATGTTTC-3DicR：5-ACAAAATACCAGATAAAGCAA-3。还公开了含有上述引物组的试剂盒及检测方法，该引物组、试剂盒和检测方法检测时间短、特异性强，检测灵敏度高，可同时检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的引物组、试剂盒及二重RT-PCR检测方法。
技术介绍
锯缘青蟹肉质鲜美、营养丰富，是我国重要的水产经济动物，在广东、福建、海南、 浙江等省沿海地区养殖广泛。但是，随着养殖规模和密度的增加，病害日益严重。自2004 年春天以来，广东省各个地区的养殖锯缘青蟹不断发生死亡，给养殖者造成了巨大的经济损失，沉重的打击了该行业的发展。通过调查研究发现，锯缘青蟹呼肠孤病毒和锯缘青蟹双顺反子病毒是造成大规模死亡的主要原因，并且在发病的锯缘青蟹中这两种病毒常常都能同时检测到。到目前为止，对于病毒病还没有有效的治疗方法，防止病毒的传染和流行是能够采取的主要措施，早期快速诊断是减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好、灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法对于疾病的预防意义重大。目前流行的多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)是一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，近年来发展出了多重PCR检测技术可能够同时检测多种病原，提高工作效率，但尚未见用于同时检测锯缘青蟹呼肠孤病毒病和锯缘青蟹双顺反子病毒的二重RT-PCR的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的引物组，该引物组能够特异性的分别扩增这两种病毒的核酸序列，可以用于这两种病毒的检测。本专利技术的目的还在于提供一种含有上述引物组的锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高，特异性好，节省时间，可以同时对这两种病毒进行检测。本专利技术的最后一个目的在于提供一种利用上述试剂盒检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的二重RT-PCR方法，该方法简便快速，特异性好，灵敏度高。本专利技术的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种用于检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的引物组，包括锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组和锯缘青蟹双顺反子病毒引物组，其中锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组包括呼肠孤病毒正向引物ReoF和反向引物ReoR，锯缘青蟹双顺反子病毒引物组包括双顺反子病毒正向引物DicF和反向引物DicR，各引物具体如下 ReoF 5- ACTCATAGAGCAGTCATGGG-3 ReoR 5- ATATCGTCAGAATGTCGTTC-3 DicF 5- GGATACTATGGATGATGTTTC-3DicR 5- ACAAAATACCAGATAAAGCAA-3。本专利技术的第二个目的是通过如下技术方案来实现的一种含有上述引物组的锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒检测试剂盒，含有以下部件(1)A液用于RNA裂解，为Trizol液；(2)B液用于RNA萃取，为氯仿；(3)C液用于沉淀RNA，为异丙醇；(4)D液用于洗涤RNA，为体积百分含量为70%的乙醇；(5)E液用于溶解RNA，为内装DEPC水；(6)F液RT反应液;(7)G液=RT-PCR反应液，含有上述锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组呼肠孤病毒正向引物 ReoF和反向引物ReoR以及锯缘青蟹双顺反子病毒引物组双顺反子病毒正向引物DicF和反向引物DicR;(8)H液阳性对照，内装锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的阳性模板。在上述试剂盒中所述的RT反应液包括Buffer、dNTP、DEPC_H20、随机引物、RNA酶抑制剂、二硫苏糖醇 DTT、反转录酶M-MLV RT。所述的RT-PCR反应液包括含mg2+的Buffer、dNTP、锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组呼肠孤病毒正向引物ReoF、反向引物ReoR、锯缘青蟹双顺反子病毒引物组双顺反子病毒正向引物DicF、反向引物DicR和Taq酶。其中呼肠孤病毒引物组和双顺反子病毒引物组的摩尔比优选为1-5:1。在实际操作中，该试剂盒还可以包括盒子、泡沫板等，其中泡沫板的大小与盒子的底板的大小相同，可以装在盒子中，泡沫板上有不少于用于封装反应试剂小管数量的小孔， 用于封装反应试剂的小管对应置于相应的小孔中。本专利技术的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的利用上述试剂盒检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的二重RT-PCR方法，含以下步骤(1)取待检样品置于A液中，冰浴勻浆后室温静置，得勻浆液；(2)在上述勻浆液中加入B液，混勻后静置；(3)离心，取上清液，加入等体积C液，静置后离心；(4)弃上清液，用D液洗涤后，离心，得洗涤液；(5)将洗涤液吹干，加入E液溶解，得到锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的RNA提取液；(6)将锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的RNA提取液温育后，冷却；(7)取冷却后RNA提取液，加入F液中，孵育并失活后，得到RT-PCR反应模板；(8)取RT-PCR反应模板和阳性对照H液加入到G液中，混勻后离心，置于PCR仪器中；(9)在PCR仪器中进行扩增反应；(10)反应结束后加溴酚蓝混勻，经0.8%琼脂糖凝胶电泳20-30分钟后于紫外仪上观察，若在与阳性对照相同的位置同时出现两条明亮的反应条带，则为两种病毒阳性，说明待测样品含两种病毒，其中呼肠孤病毒和双顺反子病毒带的位置分别为304 bp和404bp ；若只在304 bp处出现一条带，则为呼肠孤病毒阳性；若只在404bp处出现一条带，则为双顺反子病毒阳性；否则为阴性。在上述步骤中步骤(1)中待检样品与A液的质量体积比为0. 05-0. Ig 0. 5-lmL ；步骤O)中勻浆液与B液的体积比为1-10 :1 ；步骤⑶中上清液与C液的体积比为1 :1。步骤(3)和步骤中离心时的温度为3_5°C，离心机的转速为7000-120001·/ min，离心时间为5-15min ；步骤(8)中离心时离心机的转速为500_1500r/min，离心时间为 5-15s，步骤(6)中温育时的温度为65°C，时间为5-lOmin。步骤(7)中RNA提取液与F液的体积比为1:3-5，步骤(7)中孵育时的温度为 35-38°C,孵育时间为lh，然后95°C孵育失活5-lOmin。步骤(9)中扩增反应按下列条件进行首先95°C 5min，再94°C 30s,55°C 30s, 72°C Imin 共 30 个循环，再 72°C IOmin, 10°C 保存。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果本专利技术根据从患病锯缘青蟹中分离到的呼肠孤病毒和双顺反子病毒的RNA序列，设计了两对引物，建立了反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)体系，并在此基础上进行了优化，建立了两种病毒同时定性检测方法，此方法简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于锯缘青蟹养殖过程中不同时期的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。附图说明图ι是具体实施例3中检测的感染锯缘青蟹呼肠孤病毒(Reo)和双顺反子病毒(Die) 的锯缘青蟹鳃组织样品的PCR检测结果；其中M =DNA分子量标准；N 阴性对照；P 阳性对照；Lane 1 检测样品(Reo和Dic阳性)；Lane 2 检测样品(Reo阳性)；Lane 3 检测样品 (Die阳性)；图2是实施例3中PCR扩增条件。具体实施例方式实施例1本实施例提供的用于检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的引物组，包括锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组和双本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭志勋，冯娟，苏友禄，张迪，吴开畅，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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