【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及单克隆抗体领域，特别地涉及编码这类抗体的核酸。本专利技术提供用于产生和选择真核细胞的方法，所述真核细胞表达并在其表面上展示能够特异性结合一种或多种目的抗原的抗体，特别地是全长单克隆抗体，特别是双特异性单克隆抗体。专利技术背景用于分离重组抗体的已知方法是噬菌体展示法(Hogenboom, MethodsMol.Biol.178(2002) 1-37)、核糖体 /mRNA 展不法(Lipovsek 和 Plueckthun, J.1mmunol.Method290 (2004) 51-67)和微生物细胞展不法(Boder 和 Wittrup, Nat.Biotechnol.15(1997)553-557)。US2002/0123057中报道了基于哺乳动物细胞中痘苗病毒介导的完整抗体表达的筛选系统。另一种筛选系统基于哺乳动物细胞中抗体的细胞表面表达(Ho等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA103(2006)9637-9642)。噬菌体展示允许在单轮淘洗中筛选1012至1013个克隆(Barbas III等人，(编著)，Phage D...
【技术保护点】
一种选择表达双特异性抗体的细胞的方法，包括步骤(a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中每个慢病毒病毒粒子包含双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含在EV71‑IRES上游的穴基因座或结基因座中编码第一重链可变域的核酸、和在EV71‑IRES下游的相应另一个基因座中编码第二重链可变域的核酸，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原可以相同或不同，其中真核细胞表达共同轻链，其中所述重链之一或二者还在其C末端包含跨膜结构域，和(b)根据展示的膜结合型全长双特异性抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.22 EP 11195375.8;2012.08.02 EP 12179029.91.一种选择表达双特异性抗体的细胞的方法，包括步骤 (a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中每个慢病毒病毒粒子包含双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含在EV71-1RES上游的穴基因座或结基因座中编码第一重链可变域的核酸、和在EV71-1RES下游的相应另一个基因座中编码第二重链可变域的核酸，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原可以相同或不同，其中真核细胞表达共同轻链，其中所述重链之一或二者还在其C末端包含跨膜结构域，和 (b)根据展示的膜结合型全长双特异性抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞。2.根据权利要求1的方法，特征在于仅EV71-1RES下游的重链在其C末端包含跨膜结构域。3.一种选择分泌双特异性抗体的细胞的方法，包括步骤 (a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中每个慢病毒病毒粒子包含编码分泌型双特异性抗体的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含在EV71-1RES上游的穴基因座或结基因座中编码第一重链可变域的核酸、和在EV71-1RES下游的相应另一个基因座中编码第二重链可变域的核酸，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原可以相同或不同，其中真核细胞表达共同轻链，和 (b)根据分泌型全长双特异性抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞。4.根据权利要求1至3中任一项的方法，特征在于真核细胞群体的每个细胞展示或分泌单一全长双特异性抗体。5.根据权利要求1至4中任一项的方法，表征在于，包括以下一个或多个步骤作为第一步骤: -用目的抗原免疫转基因动物，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，和/或 -通过FACS通过大批分选，选择免疫的实验动物的B细胞，和/或 -通过分开PCR扩增，获得每个B-细胞的重链编码核酸，其中采用两个独立/相继的聚合酶链反应，所述聚合酶链反应引入单一限制性位点以使得可以定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体。6.根据权利要求1至2和4至5中任一项的方法，特征在于包括步骤: -PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-1RES的第二重链的可变域编码核酸(2.2kbp)，克隆入不带跨膜结构域的第二穿梭载体，任选地如果存在第一重链的跨膜结构域，通过限制性切割和再连接入载体，移除第一重链的跨膜结构域。7.根据权利要求1至2和4至6中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5’至3’方向包含 _启动子， -编码第一全长抗体重链的第一核酸， -任选地，编码跨膜结构域或GP1-锚的核酸，-EV71-1RES, -编码第二全长抗体重链的第二核酸，和 -编码跨膜结构域或GP1-锚的核酸。8.根据权利要求3至6中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5’至3’方向包含 _启动子， -编码第一全长抗体重链的第一核酸，-EV71-1RES, -编码第二全长抗体重链的第二核酸。9.根据权利要求1至8中任一项的方法，特征在于抗体是双价双特异性抗体。10.根据权利要求1至9中任一项的方法，特征在于抗体与两种不同抗原或与相同抗原上的两个表位特异性结合。11.根据权利要求1至10中任一项的方法，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。12.根据权利要求1至11中任一项的方法，特征在于第一全长抗体轻链包含CHl结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CHl结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。13.根据权利要求1至12中任一项的方法，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgGl、IgG2或IgG4类的恒定区。14.根据权利要求1至13中任一项的方法，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。15.根据权利要求1至13中任一项的方法，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。16.根据权利要求1至15中任一项的方法，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。17.根据权利要求1至16中任一项的方法，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GP1-锚信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。18.根据权利要求1至17中任一项的方法，特征在于该跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。19.根据权利要求1至18中任一项的方法，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。20.根据权利要求1至19中任一项的方法，特征在于抗体是人源化或人抗体，特别是人抗体。21.一种选择表达抗体的细胞的方法，包括步骤 (a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中细胞群体的每个细胞展示膜结合型全长抗体，其中所述抗体的至少两条链由双顺反子表达盒编码，并且所述抗体与一种或多种抗原或相同抗原上的一个或多个表位特异性结合，和 (b)根据展示的膜结合型全长抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞， 其中，慢病毒病毒粒子群体的每个慢病毒病毒粒子包含双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含EV71-1 RES用于表达膜结合型抗体。22.根据权利要求21的方法，特征在于慢病毒病毒粒子群体的慢病毒病毒粒子的每个双顺反子表达盒编码亲本抗体的不同变体，所亲本抗体与一种或多种抗原或相同抗原上的一个或多个表位特异性结合。23.根据权利要求21至22中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5’至3’方向包含 _启动子， -编码全长抗体轻链的第一核酸，-EV71-1RES, -编码全长抗体重链的第二核酸， -可剪接内含子，和 -编码跨膜结构域或GP1-锚的核酸。24.根据权利要求21至22中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5’至3’方向包含 _启动子， -编码第一全长抗体重链的第一核酸， -任选地，编码跨膜结构域或GP1-锚的核酸，-EV71-1RES, -编码第二全长抗体重链的第二核酸，和 -编码跨膜结构域或GP1-锚的核酸。25.根据权利要求21至22中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5’至3’方向包含 _启动子， -编码全长抗体轻链的第一核酸，-EV71-1RES, -编码在其C末端与scFv连接的全长抗体重链的第二核酸， -可剪接内含子，和 -编码跨膜结构域或GP1-锚的核酸。26.根据权利要求21至22中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5’至3’方向包含 _启动子， -编码全长抗体轻链的第一核酸，-EV71-1RES, -编码在其C末端与scFab连接的全长抗体重链的第二核酸， -可剪接内含子，和 -编码跨膜结构域或GP1-锚的核酸。27.根据权利要求21至26中任一项的方法，特征在于真核细胞群体的每个细胞均展示膜结合型全长抗体并且分泌全长抗体。28.根据权利要求21至26中任一项的方法，特征在于真核细胞群体的每个细胞均展示并且分泌单一全长抗体。29.根据权利要求21至28中任一项的方法，特征在于抗体与抗原特异性结合。30.根据权利要求21至23中任一项的方法，特征在于抗体是双价单特异性抗体。31.根据权利要求21至22和24中任一项的方法，特征在于抗体是双价双特异性抗体。32.根据权利要求21至22和25至26中任一项的方法，特征在于抗体是四价双特异性抗体。33.根据权利要求21至28和31至32中任一项的方法，特征在于抗体与两种不同抗原或与相同抗原上的两个表位特异性结合。34.根据权利要求31至33中任一项的方法，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。35.根据权利要求31至34中任一项的方法，特征在于第一全长抗体轻链包含CHl结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CHl结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。36.根据权利要求21至35中任一项的方法，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgGl、IgG2或IgG4类的恒定区。37.根据权利要求21至36中任一项的方法，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。38.根据权利要求21至36中任一项的方法，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。39.根据权利要求21至38中任一项的方法，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。40.根据权利要求21至39中任一项的方法，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GP1-锚信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。41.根据权利要求21至40中任一项的方法，特征在于跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。42.根据权利要求21至41中任一项的方法，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。43.根据权利要求21至42中任一项的方法，特征在于抗体是人源化或人抗体，特别是人抗体。44.一种双顺反子表达盒，其以5’至3’方向包含 _启动子， -编码全长抗体轻链的第一核酸，-EV71-1RES, -编码全长抗体重链的第二核酸， -可剪接内含子，和 -编码跨膜结构域或GP1-锚的核酸。45.一种双顺反子表达盒，其以5’至3’方向包含 _启动子， -编码第一全长抗体重链的第一核酸，-EV71-1RES, -编码第二全长抗体重链的第二核酸，和 -编码跨膜结构域或GP1-锚的核酸。46.根据权利要求44至45中任一项的双顺反子表达盒，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。47.根据权利要求44至46中任一项的双顺反子表达盒，特征在于第一全长抗体轻链包含CHl结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CHl结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。48.根据权利要求44至47中任一项的双顺反子表达盒，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgGl、IgG2或IgG4类的恒定区。49.根据权利要求44至48中任一项的双顺反子表达盒，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。50.根据权利要求44至49中任一项的双顺反子表达盒，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。51.根据权利要求44至50中任一项的双顺反子表达盒，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。52.根据权利要求44至51中任一项的双顺反子表达盒，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GP1-锚的信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。53.根据权利要求44至52中任一项的双顺反子表达盒，特征在于跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。54.根据权利要求44至53中任一项的双顺反子表达盒，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。55.根据权利要求44至54中任一项的双顺反子表达盒，特征在于抗体是人源化或人抗体，特别是人抗体。56.真核细胞，包含根据权利要求44至55中任一项的双顺反子表达盒。57.根据权利要求56的真核细胞，特征在于双顺反子表达盒已经转导入了所述细胞中。58.根据权利要求56至57中任一项的真核细胞，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。59.根据权利要求58的真核细胞，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。60.一种包含双顺反子表达盒的慢病毒载体，所述双顺反子表达盒以5’至3’方向包含 _启动子， -编码全长抗体轻链的第一核酸，-EV71-1RES, -编码全长抗体重链的第二核酸， -可剪接内含子，和 -编码跨膜结构域或GP1-锚的核酸。61.一种包含双顺反子表达盒的慢病毒载体，所述双顺反子表达盒以5’至3’方向包含 _启动子， -编码第一全长抗体重链的第一核酸，-EV71-1RES, -编码第二全长抗体重链的第二核酸，和-编码跨膜结构域或GP1-锚的核酸。62.根据权利要求60至61中任一项的慢病毒载体，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgGl、IgG2或IgG4类的恒定区。63.根据权利要求60至62中任一项的慢病毒载体，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。64.根据权利要求60至63中任一项的慢病毒载体，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。65.根据权利要求60至64中任一项的慢病毒载体,特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。66.根据权利要求60至65中任一项的慢病毒载体，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GP1-锚的信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。67.根据权利要求60至66中任一项的慢病毒载体，特征在于跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。68.根据权利要求60至67中任一项的慢病毒载体，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。69.根据权利要求 60至68中任一项的慢病毒载体，特征在于抗体是人源化或人抗体，特别是人抗体。70.真核细胞，包含根据权利要求60至69中任一项的慢病毒载体。71.根据权利要求70的真核细胞，特征在于细胞已经转导了所述慢病毒载体。72.根据权利要求70至71中任一项的真核细胞，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。73.根据权利要求72的真核细胞，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。74.根据权利要求60至69中任一项的慢病毒载体的用途，用于产生展示或分泌或者展示且分泌全长抗体的真核细胞群体。75.根据权利要求74的用途，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。76.根据权利要求75的用途，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。77.包含两个或更多个慢病毒颗粒的慢病毒载体文库，每个慢病毒颗粒都包含根据权利要求60至69中任一项的表达载体，其中每种载体所编码的抗体彼此差异至少一个氨基酸。78.根据权利要求77的慢病毒载体文库，特征在于载体文库由1，000至1，000，000个不同的表达载体组成。79.根据权利要求77至78中任一项的慢病毒载体文库，特征在于由载体文库的载体编码的抗体在抗体的CDR之一中相差至少一个氨基酸残基。80.根据权利要求79的慢病毒载体文库，特征在于该CDR是重链CDR3。81.根据权利要求77至80中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过随机化亲本表达载体的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基，获得该表达载体文库。82.根据权利要求77至81中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过组合编码两种不同半抗体的核酸，获得该慢病毒表达载体文库。83.根据权利要求77至82中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过使用从B细胞的汇集物获得的编码HCVR和LCVR的核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，其中所述B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。84.根据权利要求77至82中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过使用从HCVR和LCVR编码核酸的汇集物选出的成对HCVR和LCVR编码核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，所述汇集物通过随机化从单一 B细胞获得的HCVR和LCVR编码核酸的至少一个密码子而获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。85.根据权利要求77至82中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过使用成对的不同HCVR编码核酸和单一 LCVR编码核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，其中所述不同的HCVR编码核酸通过随机化从单一 B细胞获得的HCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。86.根据权利要求77至82中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过使用成对的不同LCVR编码核酸和单一 HCVR编码核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，其中所述不同的LCVR编码核酸通过随机化从单一 B细胞获得的LCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。87.根据权利要求77至86中任一项的慢病毒载体文库，特征在于单一B细胞是B细胞克隆群体。88.根据权利要求77至87中任一项的慢病毒载体文库，特征在于产生慢病毒表达文库的多样性包括步骤(a): (i)从B细胞亚群分离RNA， (ii)将RNA转录成cDNA； (iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一 DNA分子汇集物； (iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二 DNA分子汇集物；和 (v)成对地提供第一DNA分子汇集物的一个成员和第二 DNA分子汇集物的一个成员的配对； 或(b): (i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA， (ii)将RNA转录成cDNA； (iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一 DNA分子； (iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二 DNA分子； (v)通过随机化第一DNA分子的至少一个密码子，产生第一 DNA分子汇集物，(Vi)通过随机化第二 DNA分子的至少一个密码子，产生第二 DNA分子汇集物，和 (vii)成对地提供第一 DNA分子汇集物的一个成员和第二 DNA分子汇集物的一个成员的配对； 或(c): (i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA， (ii)将RNA转录成cDNA； (iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一 DNA分子； (iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二 DNA分子； (v)通过随机化第一 DNA分子的至少一个密码子，产生DNA分子汇集物，和 (vi)成对地提供DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子的配对； 或⑷: (i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA， (ii)将RNA转录成cDNA； (iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一 DNA分子； (iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二 DNA分子； (v)通过随机化第二DNA分子的至少一个密码子，产生DNA分子汇集物，和 (vi)成对地提供DNA分子汇集物的一个成员和第一DNA分子的配对。89.根据权利要求77至88中任一项的慢病毒载体文库，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。90.根据权利要求77至89中任一项的慢病毒载体文库，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GP1-锚的信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。91.根据权利要求77至90中任一项的慢病毒载体文库，特征在于跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。92.根据权利要求77至91中任一项的慢病毒载体文库，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。93.包含两个或更多个真核细胞的真核细胞文库，每个细胞包含根据权利要求44至55中任一项的双顺反子表达盒或根据权利要求60至69中任一项的慢病毒载体，其中每个细胞所表达的抗体彼此差异至少一个氨基酸。94.真核细胞文库，包含根据权利要求77至92的慢病毒载体文库。95.根据权利要求94的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库的每个真核细胞表达单一抗体。96.根据权利要求94至95中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库的每个真核细胞展示单一抗体。97.根据权利要求94至96中任一项的真核细胞文库,特征在于真核细胞文库是表达抗体文库的真核细胞群体，其中编码核酸源自经免疫动物的B细胞群体。98.根据权利要求97的真核细胞文库，特征在于，就B细胞对一种或多种目的抗原的特异性，预先选择B细胞。99.根据权利要求94至98中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库是这样的真核细胞群体，其中每个细胞均包含编码与第一抗原特异性结合的全长抗体的第一表达盒和编码与第二抗原特异性结合的全长抗体的第二表达盒。100.根据权利要求94至99中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库是这样的真核细胞群体，其中每个细胞均包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒编码与第一抗原结合的第一全长抗体轻链和第一全长抗体重链，所述第二表达盒编码与第二抗原特异性结合的第二全长抗体轻链和第二全长抗体重链。101.根据权利要求94至100中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库是这样的真核细胞群体，其中每个细胞均包含编码与第一抗原特异性结合的第一全长抗体重链和与第二抗原特异性结合的第二全长抗体重链的表达盒，其中真核细胞表达共同轻链。102.根据权利要求94至102中任一项的真核细胞文库，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。103.根据权利要求94至101中任一项的真核细胞文库，特征在于第一全长抗体轻链包含CHl结构域作为恒 定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CHl结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。104.根据权利要求94至103中任一项的真核细胞文库，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgGl、IgG2或IgG4类的恒定区。105.根据权利要求94至104中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。106.根据权利要求94至105中任一项的真核细胞文库，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。107.根据权利要求94至106中任一项的真核细胞文库，特征在于分离的B细胞的群体或单一B细胞或B细胞克隆群体来自从以下选择的来源:(a)血液；(b)次级淋巴器官，特别是脾或淋巴结；(c)骨髓；和(d)包含记忆B细胞的组织。108.根据权利要求107的真核细胞文库，特征在于分离的B细胞的群体包含外周血单个核细胞(PBMC)或特别地由其组成。109.根据权利要求94至108中任一项的真核细胞文库，特征在于动物是哺乳动物，特别是大鼠、小鼠、兔或人类。110.根据权利要求109的真核细胞文库，特征在于动物是转基因小鼠或转基因兔或人。111.根据权利要求94至110中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一 B细胞包括步骤: (a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触；并且 (b)选择特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的B细胞或单一B细胞。112.根据权利要求94至111中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一 B细胞包括步骤: (a)用目的抗原或其片段或抗原决定簇包被载体； (b)使分离的B细胞的群体与载体接触并且允许B细胞借助目的抗原或其片段或抗原决定簇与载体结合； (c)移除未结合的B细胞，其中特别地载体包含珠或进一步特别地由珠组成，其中再进一步特别地，珠是顺磁珠；和 (d)从顺磁珠回收B细胞亚群或单一B细胞。113.根据权利要求94至112中任一项的真核细胞文库,特征在于通过FACS分选,实施从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一 B细胞。114.根据权利要求94至113中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一 B细胞包括步骤: (a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用荧光染料标记；和 (b)通过FACS分选法，分离与目的抗原或其片段或抗原决定簇结合的B细胞。115.根据权利要求94至114中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单 一 B细胞包括步骤: (a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触； (b)选择特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的B细胞群体或单一B细胞；和 (c)针对至少一个额外参数,选择B细胞,其中特别地,针对至少一个额外参数进行的选择是 (i)针对下述参数的正选择，所述参数选自:存在B细胞特异性标志物、特别是CD19或B220，和B细胞活力；和/或 (ii)针对下述参数的负选择，所述参数选自:IgM抗体的存在；IgD抗体的存在、细胞死亡标志物的存在、和凋亡标志物的存在。116.根据权利要求94至115中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群还包括步骤:选择类别转换的B细胞，特别是IgM阴性和/或IgD阴性B细胞、最特别地IgM阴性和IgD阴性B细胞。117.根据权利要求94至116中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一 B细胞包括步骤: (a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用第一荧光染料标记，其中荧光染料特别是AleXa647nm、Alexa488或Alexa546nm ； (b)使分离的B细胞群体的细胞与抗-1gM和/或抗-1gD抗体接触，其中抗-1gM和/或抗-1gD抗体用第二和/或第三荧光染料标记，其中第二和/或第三荧光染料在与第一荧光染料发射突光的波长不同的波长发射突光；和 (c)通过FACS分选法，分离与目的抗原或其片段或抗原决定簇结合但是不与抗-1gM结合和/或不与抗-1gD抗体结合的B细胞群体或单一 B细胞。118.根据权利要求94至117中任一项的真核细胞文库，特征在于文库是病毒文库，特别地是慢病毒文库，并且通过用病毒文库、特别用慢病毒文库感染真核细胞、特别地哺乳动物细胞，将文库引入第一真核细胞群体、特别是第一哺乳动物细胞群体，其中还特别地，感染以最多10、特别地最多1、更特别地最多0.2和最特别地最多0.1的感染复数进行。119.根据权利要求118的真核细胞文库，特征在于感染复数是约0.1。120.根据权利要求94至119中任一项的真核细胞文库，特征在于通过FACS分选，实施细胞的分离。在一个实施方案中，细胞的分离包括步骤: (a)用目的抗原或其片段或抗原决定簇染色第一真核细胞群体、特别是哺乳动物细胞群体，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用荧光染料标记；和 (b)通过FA...
【专利技术属性】
技术研发人员：P·M·许尔斯曼，H·克内根，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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