用于重组表达感兴趣产物的新型真核细胞和方法技术

本公开涉及适合重组生产感兴趣产物的新型真核细胞，其中例如通过减少或消除基因FAM60A的功能表达，改变所述宿主细胞基因组，从而蛋白FAM60A在所述细胞中的效果受损，由此提高稳定特性。此外，本公开提供相关技术，其中这类宿主细胞被用于重组生产技术。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及重组表达
提供了能以增加的稳定性表达感兴趣产物的经改变真核细胞以及其在重组表达方法中的应用等。此外，提供能在选择过程早期基于真核细胞表达谱鉴定以提高的稳定性表达重组产物的真核细胞。所述真核细胞优选是哺乳动物细胞。
技术介绍
随着生物制药对当今医学越来越重要，生物制药市场持续高速增长。目前，越来越多的生物药品在真核细胞如特定的哺乳动物细胞中生产。因此，在真核细胞中成功且高产率生产生物药品是关键的。产生这类生产感兴趣治疗蛋白的细胞系的时间是任何生物药品进入临床所需时间的重要部分。此外，也鉴于生物药品和其他重组产品的生产成本，拥有高表达但尤其也能稳定表达的重组真核细胞系很重要，特别是哺乳动物细胞系。为了生物制药尤其是在工业规模上的生产效率，对克隆选择工艺付出巨大努力，目标是在短时间内鉴定有良好稳定性和生长特性的高产克隆。然而，即使在筛选过程中鉴定出高表达克隆，这些初始高表达克隆通常随着时间推移而失去其有利表达特性且表达产率减小。延长的继代培养期间细胞克隆中重组蛋白表达的逐步损失是许多细胞系如CHO细胞系的共同问题，称为不稳定性。此不稳定性严重影响重组生产多肽的工业生产过程。预期生产不稳定的原因与重组基因拷贝损失相关，这是由于宿主细胞遗传不稳定和转基因序列的表观遗传沉默所引起。此外，发现不稳定率可根据相应项目(即待表达的个体产物)而变化。在真核细胞系中观察到25％-多至几乎90％的不稳定率。因此，必须审慎其事，才能从成功表达的细胞群体中，甚至从初时以良好产率表达感兴趣蛋白的细胞克隆中鉴定出如下细胞/个别细胞克隆：它们在长期培养中兼具高度生产稳定性，因而不易表现出重组蛋白表达逐渐损失。这些克隆也称为“稳定”克隆。在长时间培养期中，稳定克隆应在8-12周时间内(例如10周)损失不超过初始生产率的30％，优选不超过25％。生产率定义为容积生产率，其是在某
一培养时间点每体积蛋白的表达量(如g/L)，个别地，作为细胞比生产率，是每天每细胞表达蛋白的具体量(如pg/细胞/天)。为防止有倾向于不稳定并因而在长时间培养中会损失效价的细胞克隆被选择用于后续大规模生产，通常在数周到多至数月中进行广泛的稳定性分析以去除在该时间段中变得不稳定的那些细胞克隆并鉴定稳定克隆。因此，大规模生产的治疗蛋白和其它重组多肽所用重组细胞克隆的产生通常包括通过耗时的稳定性研究过量筛选个体克隆以鉴定能显示大规模生产所需表达稳定性的细胞克隆。此减少不稳定克隆和鉴定稳定克隆的筛选实践延长生物技术生产过程的开发。甚至当使用在所用选择条件下有利于高表达细胞存活的高严谨选择系统时，仍难以在存活群体内发现结合高表达率与良好生长和稳定特性的合适生产克隆。本专利技术的一个目的是提高感兴趣产物在真核细胞例如尤其是哺乳动物细胞中的重组生产。具体地，本专利技术的一个目的是提供新型真核细胞系，其在用编码感兴趣产物的多核苷酸稳定转染后，以提高的稳定特性表达感兴趣产物。特别地，目的是提供重组真核细胞，其中在长时间培养期间明显损失生产率的风险降低。另外，一个目的是采用稳定转染的真核细胞，尤其是哺乳动物细胞，提供重组生产感兴趣产物的改良方法。此外，一个目的是提供能在开发过程早期区分稳定与不稳定细胞克隆的分析工具。
技术实现思路
本公开尤其基于以下意外发现：例如通过减少或消除FAM60A基因的功能表达，改变真核细胞基因组以削弱蛋白FAM60A在所述细胞中的效果，可显著增加感兴趣的重组产物在所述细胞中的表达稳定性。对于FAM60A基因，鉴定了影响重组表达稳定性的一个关键基因。削弱FAM60A在细胞中的效果，能通过增加表达稳定性来显著提高感兴趣产物的重组生产。如实施例所示，用本文所述新型真核细胞作为宿主细胞时，在选择后获得显示明显提高稳定特性的重组细胞克隆。就相应宿主细胞而言，相较其中基因组未改变以削弱蛋白FAM60A在细胞中效果的细胞，长时间培养期间的表达稳定性的明显损失更少见；而且若出现，引起的生产率减少相较细胞不太显著。稳定转染后稳定克隆的丰度增加。因此，可缩短或甚至跳过鉴定宿主细胞的稳定性分析，所述宿主细胞不倾向或不太倾向于不稳定。这是一个重要优势，因为其缩短获得
稳定表达型细胞克隆所需的时间，所述细胞克隆在延长时间段中以高产率表达感兴趣的重组产物并因而适合大规模生产目的。因此，本专利技术显著减少筛选工作并对现有技术作出重要贡献。根据第一方面，本公开提供经分离真核细胞，其中该真核细胞的基因组被改变，从而蛋白FAM60A在所述细胞中的效果受损且其中所述细胞包括整合入其基因组的编码感兴趣产物的异源多核苷酸。蛋白FAM60A在所述细胞中的效果可能通过如减少或消除内源基因FAM60A的功能表达而受损，例如通过基因沉默、基因缺失或通过突变基因从而表达无功能蛋白或功能更少的蛋白。本文也描述了其它选择。根据第二方面，提供选择重组表达感兴趣产物的宿主细胞的方法，包括(a)提供第一方面所述真核细胞作为宿主细胞；和(b)选择一或多个表达感兴趣产物的宿主细胞。根据第三方面，提供重组生产感兴趣产物的方法，包括使用第一方面所述真核细胞作为宿主细胞用于重组表达感兴趣产物。感兴趣产物由稳定整合入第一方面所述真核细胞基因组的异源多核苷酸编码。如上所述，由于其有利的表达稳定特性，这些新型真核细胞尤其适合作为宿主细胞用于重组生产感兴趣产物。根据第四方面，提供适合重组产生感兴趣产物的真核细胞的生产方法，包括如下削弱蛋白FAM60A在真核细胞中的效果：改变所述细胞基因组并将至少一个表达载体稳定转染入所述细胞，所述载体包括编码感兴趣产物的多核苷酸。FAM60A在所述细胞中的效果例如通过减少或消除基因FAM60A的功能表达而可能受损。根据第五方面，提供方法分析真核细胞作为宿主细胞以稳定表达感兴趣重组产物的适宜性，包括直接或间接分析蛋白FAM60A在所述细胞中的效果是否受损。此方法可有利使用，例如联合第四方面所述方法以鉴定是否获得其中蛋白FAM60A在该细胞中的效果受损的真核细胞。此外，该方法能用作分析工具以在选择过程早期区分表达感兴趣产物的稳定与不稳定细胞克隆。根据第六方面，本公开涉及经分离真核细胞在重组表达感兴趣产物
中的应用，其中所述真核细胞的基因组被改变从而蛋白FAM60A在所述细胞中的效果受损。本申请的其它目的、特征、优点和方面通过以下说明书和所附权利要求对本领域技术人员来说是显而易见的。然而，应理解以下说明书、所附权利要求和特定实施例尽管指示本申请的优选实施方式，但仅作为例证给出。通过阅读以下内容，在所公开的专利技术精神和范围内的多种变化和修饰对本领域技术人员来说将是显而易见的。附图说明图1提供中国仓鼠卵巢(CHO)细胞染色体8端粒区和位于所述端粒区的基因的概述图。图中所示基因组区域是染色体8上合并拼接序列(scaffold)6和25号的结果。使用与Brinkrolf等.(Nature Biotechnology卷31,694–695(2013)；参见基因库:APMK00000000,APMK01000000版，如所述出版物所述)的装配相关的基因库注释文件，可找到关于CHO细胞染色体8上基因和推定基因的概述。此外，北京华大基因公司还提供该区域的注释(Xu等,N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经分离真核细胞，其中所述真核细胞的基因组改变，从而蛋白FAM60A在所述细胞中的效果受损，且其中所述细胞包括整合入其基因组的编码感兴趣产物的至少一种异源多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.20 US 61/919,3401.一种经分离真核细胞，其中所述真核细胞的基因组改变，从而蛋白FAM60A在所述细胞中的效果受损，且其中所述细胞包括整合入其基因组的编码感兴趣产物的至少一种异源多核苷酸。2.如权利要求1所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述蛋白FAM60A的效果受损是因为基因FAM60A在所述细胞中的功能表达被减少或消除。3.如权利要求2所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述真核细胞改变成通过基因敲除、基因突变、基因缺失、基因沉默或上述的任意组合来减少或消除基因FAM60A的功能表达。4.如权利要求3所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述FAM60A基因包括FAM60A基因中的一个或多个突变作为基因突变，其提供无功能或功能较少的表达产物。5.如权利要求3或4所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述基因FAM60A的至少一个拷贝在真核细胞基因组中缺失或功能失活。6.如权利要求1-5中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述真核细胞是后生动物细胞、脊椎动物细胞或哺乳动物细胞。7.如权利要求6所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述真核细胞是哺乳动物细胞。8.如权利要求1-7中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，一部分染色体缺失，其中所述缺失部分包括基因FAM60A。9.如权利要求8所述的经分离真核细胞，其特征在于a)所述真核细胞是仓鼠细胞且至少一部分染色体8端粒区缺失，其中所述缺失部分包括基因FAM60A；或b)所述真核细胞是小鼠细胞且至少一部分染色体6端粒区缺失，其中所述缺失部分包括基因FAM60A。10.如权利要求9所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述细胞具有一个或多个以下特征：a)所述缺失的端粒区包括基因FAM60A且包括一个或多个选自Caprin2
\t和Ipo8的基因；b)所述缺失由染色体断裂诱导且断点位于Ipo8基因着丝粒端，优选位于Tmtc1基因内；c)至少一部分端粒区在相应染色体对的两条染色体中都缺失，其中所述缺失部分包括基因FAM60A。11.如权利要求1-10中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述细胞具有一个或多个以下特征：a)所述真核细胞是啮齿动物细胞，b)所述真核细胞是仓鼠细胞，优选CHO细胞，c)所述真核细胞内源表达DHFR和叶酸受体，和/或d)所述真核细胞作为细胞克隆或细胞系提供。12.如权利要求1-11中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述内源FAM60A蛋白与一种或多种SEQ ID NO:1-8所示氨基酸序列共有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或同一性。13.如权利要求1-12中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，额外削弱基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果，优选通过减少或消除基因C12orf35的功能表达来削弱。14.如权利要求13所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述C12orf35基因编码的蛋白与一个或多个SEQ ID NO:10-16所示氨基酸序列或SEQ ID NO 17所编码蛋白共有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性。15.如权利要求1-14中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述真核细胞包括稳定整合入其基因组的至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸和至少一种编码选择标记或报告多肽的异源多核苷酸，且其中这些异源多核苷酸位于相同或不同的表达载体。16.如权利要求1-15中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述细胞具有一个或多个以下特征：a)所述感兴趣产物是多肽；b)所述感兴趣产物是多肽且真核细胞分泌所述感兴趣多肽到细胞培养基中；和/或c)所述感兴趣产物是选自治疗多肽和诊断多肽的多肽。17.如权利要求1-16中一项或多项所述的经分离真核细胞，其源自相应细胞群，通常源自所述相应细胞群的至少40％、优选至少50％的细胞在8周时间段中不损失其超过30％、优选不超过25％的表达效价(体积)，优选10周，更优选12周时间段。18.一种选择重组表达感兴趣产物的宿主细胞的方法，所述方法包括(a)提供如权利要求1-17中一项或多项所述的真核细胞作为宿主细胞；和(b)选择一个或多个表达感兴趣产物的宿主细胞。19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，阶段(a)包括用至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸转染其中基因组改变从而蛋白FAM60A在细胞中效果受损的真核细胞，来提供真核宿主细胞，所述真核...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·约斯托克，H·劳克斯，A·瑞特，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH