表达具有共同轻链的抗体的非人动物制造技术

提供了遗传修饰的小鼠，其中小鼠表达特征在于有限数目的轻链可变结构域的免疫球蛋白轻链库。提供了仅表达一个或少数来自它们的种系中的有限库的免疫球蛋白轻链可变结构域的小鼠。提供了用于在小鼠中产生轻链可变区包括人轻链可变区的方法。提供了用于产生适合用于多特异性结合蛋白例如双特异性抗体的人可变区的方法。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为201280026269.6的专利申请的分案申请。专利
提供了表达抗体的遗传修饰的小鼠，所述抗体具有与多种人可变/小鼠恒定重链缔和的共有人可变/小鼠恒定轻链。提供了用于从小鼠的B细胞的人可变区基因序列制备人双特异性抗体的方法。背景抗体通常包含同二聚体重链组分，其中每个重链单体与相同的轻链缔和。具有异二聚体重链组分的抗体(例如双特异性抗体)作为治疗性抗体是理想的。但是制备具有能够令人满意地与双特异性抗体的每个重链缔和的合适的轻链组分的双特异性抗体被证明是存在问题的。在一种方法中，可通过测定所有轻链可变结构域的使用统计学、鉴定人类抗体中最常使用的轻链并在体外将这样的轻链与不同特异性的两个重量配对来选择轻链。在另一种方法中，可通过观察噬菌体展示文库(例如包含人轻链可变区序列的噬菌体展示文库，例如人scFv文库)中的轻链序列并从该文库中选择最常使用的轻链可变区来选择轻链。然后，可以在感兴趣的两个不同重链上测试这样的轻链。在另一种方法中，可以通过测定轻链可变序列的噬菌体展示文库(使用感兴趣的两个重链的重链可变序列作为探针)来选择轻链。与两个重链可变序列缔和的轻链可被选择为所述重链的轻链。在另一种方法中，可以将候选轻链与重链的同源轻链比对，并在轻链中进行修饰以更紧密地匹配两个重链的同源轻链的特征性共有的序列。如果需要使免疫原性的机会最小化，则所述修饰优选产生存在于已知的人轻链序列中的序列，从而不太可能发生蛋白水解处理以产生T细胞表位(基于本领域已知的用于测定免疫原性可能性的参数和方法(即计算机测定以及湿法测定)。所有上述方法都依赖于体外方法，其包含了多种事先限制，例如序列同一性，与特定的预先选择的重链缔和的能力，等等。本领域需要不依赖于体外操作条件的组合物和方法，而是使用更加生物敏感的方法来制备包括共有轻链的人表位结合性蛋白。概述提供了表达人免疫球蛋白重链和轻链可变结构域的遗传修饰的小鼠，其中小鼠具有有限的轻链可变库。提供了用于产生人轻链可变结构域的生物系统，所述轻链可变结构域与亲和力成熟的人重链可变结构域的不同库缔合并一起表达。提供了用于产生包含免疫球蛋白可变结构域的结合蛋白的方法，包括用目的抗原免疫具有有限的免疫球蛋白轻链库的小鼠，和在结合蛋白中使用特异性结合目的抗原的小鼠的免疫球蛋白可变区基因序列。方法包括用于产生适合用于产生多特异性抗原结合蛋白的人免疫球蛋白重链可变结构域的方法。提供了遗传工程化的小鼠，所述小鼠选择来源于未重排的人重链可变区基因区段的库的适当的亲和力成熟的人免疫球蛋白重链可变结构域，其中亲和力成熟的人重链可变结构域与来源于一个人轻链可变区基因区段的单个人轻链可变结构域缔合并一起表达。还提供了遗传工程化的小鼠，所述小鼠提供了两个人轻链可变区基因区段的选择。提供了遗传工程化的小鼠，所述小鼠从人轻链可变区基因区段的有限库表达人轻链可变结构域的有限库或单个人轻链可变结构域。小鼠被遗传工程化以包括单个未重排的人轻链可变区基因区段(或两个人轻链可变区基因区段)，所述可变区基因区段重排以形成表达单个轻链(或表达两个轻链之任一或两者)的重排的人轻链可变区基因(或两个重排的轻链可变区基因)。重排的人轻链可变结构域能够与多个由小鼠选择的亲和力成熟的人重链配对，其中所述重链可变区特异性结合不同表位。提供了从人轻链可变区序列的有限库表达人轻链可变结构域的有限库或单个人轻链可变结构域的遗传工程化的小鼠。通过对小鼠进行遗传工程化以包括表达单个轻链的可变区(或表达两个可变区之任一或两者)的单个V/J人轻链序列(或两个V/J序列)。包含可变序列的轻链能够与多个由小鼠克隆地选择的亲和力成熟的人重链配对，其中所述重链可变区特异性结合不同表位。在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，所述小鼠包含单个能够与人J基因区段(选自一个或多个JL区段)重排和编码免疫球蛋白轻链的人VL结构域的人免疫球蛋白轻链可变(VL)区基因区段。在另一个方面，小鼠包含不超过两个人VL基因区段，其各自能够与人J基因区段(选自一个或多个JL区段)重排并且编码免疫球蛋白轻链的人VL结构域。在一个实施方案中，单个人VL基因区段有效地连接于选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5的人JL基因区段，其中单个人VL基因区段能够重排以形成编码具有一个或多个人JL基因区段的任一个的轻链可变区基因的序列。在一个实施方案中，遗传修饰的小鼠包含免疫球蛋白轻链基因座，所述基因座不包含能够重排以形成免疫球蛋白轻链基因的内源小鼠VL基因区段，其中VL基因座包含单个能够重排以编码轻链基因的VL区的人VL基因区段。在具体的实施方案中，人VL基因区段是人Vκ1-39Jκ5基因区段或人Vκ3-20Jκ1基因区段。在一个实施方案中，遗传修饰的小鼠包含VL基因座，所述基因座不包含能够重排以形成免疫球蛋白轻链基因的内源小鼠VL基因区段，其中VL基因座包含不超过2个能够重排以编码轻链基因的VL区的人VL基因区段。在具体的实施方案中，所述不超过2个人VL基因区段是人Vκ1-39Jκ5基因区段和人Vκ3-20Jκ1基因区段。在一个方面，提供了包含单个编码免疫球蛋白轻链的人VL结构域的重排的(V/J)人免疫球蛋白轻链可变(VL)区(即，VL/JL区)的遗传修饰的小鼠。在另一个方面，小鼠包含不超过2个能够编码免疫球蛋白轻链的人VL结构域的重排的人VL区。在一个实施方案中，VL区是重排的人Vκ1-39/J序列或重排的人Vκ3-20/J序列。在一个实施方案中，重排的VL/JL序列的人JL区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。在具体的实施方案中，VL区是人Vκ1-39Jκ5序列或人Vκ3-20Jκ1序列。在具体的实施方案中，小鼠具有人Vκ1-39Jκ5序列和人Vκ3-20Jκ1序列。在一个实施方案中，人VL基因区段有效地连接于人或小鼠前导序列。在一个实施方案中，前导序列是小鼠前导序列。在具体的实施方案中，小鼠前导序列是小鼠Vκ3-7前导序列。在具体的实施方案中，前导序列有效地连接于未重排的人VL基因区段。在具体的实施方案中，前导序列有效地连接于重排的人VL/JL序列。在一个实施方案中，VL基因区段有效地连接于免疫球蛋白启动子序列。在一个实施方案中，启动子序列是人启动子序列。在具体的实施方案中，人免疫球蛋白启动子是人Vκ3-15启动子。在具体的实施方案中，启动子有效地连接于未重排的人VL基因区段。在具体的实施方案中，启动子有效地连接于重排的人VL/JL序列。在一个实施方案中，轻链基因座包含前导序列，其在5’(相对于VL基因区段的转录方向)与人免疫球蛋白启动子侧翼连接，在3’与人VL基因区段侧翼连接，所述人VL基因区段与人J区段重排，并且编码包含内源小鼠轻链恒定区(CL)的反向嵌合轻链的VL结构域。在具体的实施方案中，VL基因区段位于小鼠Vκ基因座中，并且小鼠CL是小鼠Cκ。在一个实施方案中，轻链基因座包含前导序列，其在5’(相对于VL基因区段的转录方向)与人免疫球蛋白启动子侧翼连接，在3’与重排的人VL区(VL/JL序列)侧翼连接，并且编码包含内源小鼠轻链恒定区(CL)的反向嵌合轻链的VL结构域。在具体的实施方案中，重排的人VL/JL序列为于小鼠κ本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备双特异性抗原结合蛋白的方法，包括：(a)表达包含由第一人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第一人免疫球蛋白重链，所述第一人免疫球蛋白重链可变区源自使用包含第一表位的第一目标抗原免疫的第一遗传工程化的小鼠的B细胞，所述小鼠：(i)具有对于单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为纯合或杂合的种系，所述单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为Vκ1‑39/Jκ序列，其中单重排的人Vκ1‑39/Jκ序列包含人种系Vκ1‑39基因区段和人种系Jκ基因区段，可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且其中人免疫球蛋白轻链可变结构域表达自与单重排的人Vκ1‑39/Jκ序列相同的序列或表达自单重排的人Vκ1‑39/Jκ序列的体细胞高度突变的变体；和(b)表达包含由第二人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第二人免疫球蛋白重链，所述第二人免疫球蛋白重链可变区源自使用包含第二表位的第二目标抗原免疫的第二遗传工程化的小鼠的B细胞，所述小鼠：(i)具有对于单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为纯合或杂合的种系，所述单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为Vκ1‑39/Jκ序列，其中单重排的人Vκ1‑39/Jκ序列包含人种系Vκ1‑39基因区段和人种系Jκ基因区段，可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且其中人免疫球蛋白轻链可变结构域表达自与单重排的人Vκ1‑39/Jκ序列相同的序列或表达自单重排的人Vκ1‑39/Jκ序列的体细胞高度突变的变体；和(c)使所表达的包含由第一人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第一人免疫球蛋白重链与一个人免疫球蛋白轻链配对并且与所表达的第二人免疫球蛋白重链配对，所述第二人免疫球蛋白重链也与所述人免疫球蛋白轻链配对，所述第二人免疫球蛋白重链包含由第二人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域，其中所述第一或第二人免疫球蛋白重链可变区的至少一个源自选自下列的重排的人VH/D/JH区：1‑69/6‑13/4,1‑69/6‑6/5，2‑5/3‑22/1，3‑13/6‑6/5，3‑23/2‑8/4，3‑23/6‑6/4，3‑23/7‑27/4，3‑30/1‑1/4，3‑30/3‑3/4，3‑30/5‑5/2和3‑30/7‑27/6，从而制备双特异性抗原结合蛋白。...

【技术特征摘要】
2011.04.25 US 13/093,1561.制备双特异性抗原结合蛋白的方法，包括：(a)表达包含由第一人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第一人免疫球蛋白重链，所述第一人免疫球蛋白重链可变区源自使用包含第一表位的第一目标抗原免疫的第一遗传工程化的小鼠的B细胞，所述小鼠：(i)具有对于单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为纯合或杂合的种系，所述单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为Vκ1-39/Jκ序列，其中单重排的人Vκ1-39/Jκ序列包含人种系Vκ1-39基因区段和人种系Jκ基因区段，可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且其中人免疫球蛋白轻链可变结构域表达自与单重排的人Vκ1-39/Jκ序列相同的序列或表达自单重排的人Vκ1-39/Jκ序列的体细胞高度突变的变体；和(b)表达包含由第二人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第二人免疫球蛋白重链，所述第二人免疫球蛋白重链可变区源自使用包含第二表位的第二目标抗原免疫的第二遗传工程化的小鼠的B细胞，所述小鼠：(i)具有对于单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为纯合或杂合的种系，所述单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为Vκ1-39/Jκ序列，其中单重排的人Vκ1-39/Jκ序列包含人种系Vκ1-39基因区段和人种系Jκ基因区段，可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且其中人免疫球蛋白轻链可变结构域表达自与单重排的人Vκ1-39/Jκ序列相同的序列或表达自单重排的人Vκ1-39/Jκ序列的体细胞高度突变的变体；和(c)使所表达的包含由第一人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第一人免疫球蛋白重链与一个人免疫球蛋白轻链配对并且与所表达的第二人免疫球蛋白重链配对，所述第二人免疫球蛋白重链也与所述人免疫球蛋白轻链配对，所述第二人免疫球蛋白重链包含由第二人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域，其中所述第一或第二人免疫球蛋白重链可变区的至少一个源自选自下列的重排的人VH/D/JH区：1-69/6-13/4,1-69/6-6/5，2-5/3-22/1，3-13/6-6/5，3-23/2-8/4，3-23/6-6/4，3-23/7-27/4，3-30/1-1/4，3-30/3-3/4，3-30/5-5/2和3-30/7-27/6，从而制备双特异性抗原结合蛋白。2.制备双特异性抗原结合蛋白的方法，包括：(a)表达包含由第一人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第一人免疫球蛋白重链，所述第一人免疫球蛋白重链可变区源自使用包含第一表位的第一目标抗原免疫的第一遗传工程化的小鼠的B细胞，所述小鼠：(i)具有对于单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为纯合或杂合的种系，所述单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为Vκ1-39/Jκ序列，其中单重排的人Vκ1-39/Jκ序列包含人种系Vκ1-39基因区段和人种系Jκ基因区段，可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且其中人免疫球蛋白轻链可变结构域表达自与单重排的人Vκ1-39/Jκ序列相同的序列或表达自单重排的人Vκ1-39/Jκ序列的体细胞高度突变的变体；(ii)具有包括未重排的人VH基因区段、人D基因区段和人JH基因区段的种系，所述未重排的人VH基因区段可操作地连接于鼠CH区；和(b)表达包含由第二人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第二人免疫球蛋白重链，所述第二人免疫球蛋白重链可变区源自使用包含第二表位的第二目标抗原免疫的第二遗传工程化的小鼠的B细胞，所述小鼠：(i)具有对于单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为纯合或杂合的种系，所述单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为Vκ1-39/Jκ序列，其中单重排的人Vκ1-39/Jκ序列包含人种系Vκ1-39基因区段和人种系Jκ基因区段，可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且其中人免疫球蛋白轻链可变结构域表达自与单重排的人Vκ1-39/Jκ序列相同的序列或表达自单重排的人Vκ1-39/Jκ序列的体细胞高度突变的变体；(ii)具有包括未重排的人VH基因区段、人D基因区段和人JH基因区段的种系，所述未重排的人VH基因区段可操作地连接于鼠CH区；和(c)使所表达的包含由第一人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第一人免疫球蛋白重链与一个人免疫球蛋白轻链配对并且与所表达的第二人免疫球蛋白重链配对，所述第二人免疫球蛋白重链也与所述人免疫球蛋白轻链配对，所述第二人免疫球蛋白重链包含由第二人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域，其中所述第一或第二人免疫球蛋白重链可变区的至少一个源自人VH1-69基因区段，从而制备双特异性抗原结合蛋白。3.权利要求1或权利要求2的方法，其中源自第一小鼠或第二小鼠中表达的重排的人Vκ1-39/Jκ序列的人免疫球蛋白轻链可变结构域由源自相同重排的人种系J区段的核苷酸序列编码。4.权利要求1-3任一项的方法，其中相同重排的人种系J区段是重排的人免疫球蛋白Jκ5。5.制备双特异性抗原结合蛋白的方法，包括：(a)表达包含由第一人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第一人免疫球蛋白重链，所述第一人免疫球蛋白重链可变区源自使用包含第一表位的第一目标抗原免疫的第一遗传工程化的小鼠的B细胞，所述小鼠：(i)具有对于单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为纯合或杂合的种系，所述单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为Vκ3-20/Jκ序列，其中单重排的人Vκ3-20/Jκ序列包含人种系Vκ3-20基因区段和人种系Jκ基因区段，可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且其中人免疫球蛋白轻链可变结构域表达自与单重排的人Vκ3-20/Jκ序列相同的序列或表达自单重排的人Vκ3-20/Jκ序列的体细胞高度突变的变体；和(b)表达包含由第二人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第二人免疫球蛋白重链，所述第二人免疫球蛋白重链可变区源自使用包含第二表位的第二目标抗原免疫的第二遗传工程化的小鼠的B细胞，所述小鼠：(i)具有对于单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为纯合或杂合的种系，所述单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为Vκ3-20/Jκ序列，其中单重排的人Vκ3-20/Jκ序列包含人种系Vκ3-20基因区段和人种系Jκ基因区段，可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且其中人免疫球蛋白轻链可变结构域表达自与单重排的人Vκ3-20/Jκ序列相同的序列或表达自单重排的人Vκ3-20/Jκ序列的体细胞高度突变的变体；和(c)使所表达的包含由第一人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第一人免疫球蛋白重链与一个人免疫球蛋白轻链配对并且与所表达的第二人免疫球蛋白重链配对，所述第二人免疫球蛋白重链也与所述人免疫球蛋白轻链配对，所述第二人免疫球蛋白重链包含由第二人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域，其中所述第一或第二人免疫球蛋白重链可变区的至少一个源自选自下列的重排的人VH/D/JH区：3-30/3-3/3，3-33/1-7/4，3-33/2-15/4和3-53/1-1/4，从而制备双特异性抗原结合蛋白。6.制备双特异性抗原结合蛋白的方法，包括：(a)表达包含由第一人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第一人免疫球蛋白重链，所述第一人免疫球蛋白重链可变区源自使用包含第一表位的第一目标抗原免疫的第一遗传工程化的小鼠的B细胞，所述小鼠：(i)具有对于单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为纯合或杂合的种系，所述单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为Vκ3-20/Jκ序列，其中单重排的人Vκ3-20/Jκ序列包含人种系Vκ3-20基因区段和人种系Jκ基因区段，可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且其中人免疫球蛋白轻链可变结构域表达自与单重排的人Vκ3-20/Jκ序列相同的序列或表达自单重排的人Vκ3-20/Jκ序列的体细胞高度突变的变体；(ii)具有包括未重排的人VH基因区段、人D基因区段和人JH基因区段的种系，所述未重排的人VH基因区段可操作地连接于鼠CH区；和(b)表达包含由第二人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第二人免疫球蛋白重链，所述第二人免疫球蛋白重链可变区源自使用包含第二表位的第二目标抗原免疫的第二遗传工程化的小鼠的B细胞，所述小鼠：(i)具有对于单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为纯合或杂合的种系，所述单重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列为Vκ3-20/Jκ序列，其中单重排的人Vκ3-20/Jκ序列包含人种系Vκ3-20基因区段和人种系Jκ基因区段，可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且其中人免疫球蛋白轻链可变结构域表达自与单重排的人Vκ3-20/Jκ序列相同的序列或表达自单重排的人Vκ3-20/Jκ序列的体细胞高度突变的变体；(ii)具有包括未重排的人VH基因区段、人D基因区段和人JH基因区段的种系，所述未重排的人VH基因区段可操作地连接于鼠CH区；和(c)使所表达的包含由第一人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第一人免疫球蛋白重链与一个人免疫球蛋白轻链配对并且与所表达的第二人免疫球蛋白重链配对，所述第二人免疫球蛋白重链也与所述人免疫球蛋白轻链配对，所述第二人免疫球蛋白重链包含由第二人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域，其中所述第一或第二人免疫球蛋白重链可变区的至少一个源自...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·麦克沃克，L·麦克唐纳，S·史蒂文斯，S·戴维斯，D·R·巴克勒，K·A·霍希亚瓦，A·J·莫菲，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US