基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法，包括由插入有目的基因靶位点的报告基因I表达盒、完整的报告基因II表达盒以及报告基因I的截短序列构建的双荧光报告系统表达载体，本发明专利技术所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统利用并模拟真核细胞内的不同修复机制对报告系统中的相应的荧光表达盒进行修复，可通过流式细胞仪对双荧光报告系统表达载体两种报告基因的表达进行量化，在载体水平一次性报告检测真核细胞中某一确定基因位点HR、SSA和NHEJ的修复效率。

【技术实现步骤摘要】
基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法
本专利技术属于基因工程
，涉及一套基于人工核酸酶介导的快速、高效、可视化细胞修复效率报告系统的构建方法，具体涉及应用基因工程技术在报告载体水平模拟真核细胞内特定基因位点的损伤，对不同修复通路的修复效率进行可视化的粗略定量和流式分析精确定量的方法。
技术介绍
基因组编辑技术是针对基因组进行基因修饰和改造的一种生物工程技术，该技术是人们认识、鉴定基因功能的“金钥匙”。早期的转基因技术主要是利用随机插入的方式将外源基因整合到基因组中，比较常用且高效的手段是转座子系统介导的转座效应和逆转录病毒介导的整合效应。但是利用以上两种效应介导的基因敲入一般具有一定的随机性、多拷贝性和细胞毒性，有着潜在的安全问题，因此在基因治疗和转基因育种等领域的研究应用中受到了很大的限制。基因组靶向编辑技术则可以针对基因组某一特定位点进行靶向编辑和修饰操作，避免了随机性和多拷贝性，降低了细胞毒性。传统的基因组靶向编辑技术通过打靶载体，利用细胞内自发的同源重组(Homologousrecombination,HR)效应实现目的基因的定点插入。打靶载体需要含有两段很长的同源臂(基因组中靶基因的序列)、筛选标记基因以及需要引入的外源基因序列。在基因组DNA复制过程中，打靶载体的同源臂在自发同源重组的机制下能整合至基因组相应位点，同时将外源基因插入靶基因位点。最后通过筛选标记基因筛选获得目的基因插入的阳性细胞克隆。但是，对于高等动物而言，这种自发重组的效率非常低(10-6～10-7左右)，且单纯地延长打靶载体中同源臂序列的长度并不能有效的提高其重组效率。因此，这种依靠自发重组所介导的基因组靶向编辑技术由于效率低、经费时间投入大和实验技术要求高等缺点，已经难以满足应用的需求；特异性和高效性一度成为该技术中的两个重点和难点。人工核酸内切酶(Engineeredendonuclease,EEN)的出现，为基因组靶向编辑技术带了新的革命。新型的基因组靶向编辑技术主要是通过人工核酸内切酶特异性地在基因组靶序列处引入双链断裂(Double-strandedbreaks,DSBs)，利用含有同源臂的供体DNA介导同源重组修复机制，进而实现基因的插入、删除和点编辑。人工核酸内切酶可以根据特异性靶序列DNA进行专门的改造和定制，大大提高了基因组靶向编辑的特异性；同时，在基因组DNA中引入双链断裂后，基因组靶向编辑的效率也得到了飞跃性的提高。目前，应用于基因组靶向编辑技术中的人工核酸内切酶主要包括3种：锌指核酸酶技术(Zincfingernucleases,ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9核酸酶技术(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas))。自然情况下细胞基因组中发生DSBs后主要通过以下3种机制进行修复：(1)非同源末端连接(Non-HomologousEndJoining,NHEJ)是细胞中DSBs的主要修复方式，断裂DNA分子两端可以直接通过非特异性的末端连接实现修复，同时可能会引入少量核苷酸碱基的插入或缺失(Insertionsanddeletions,Indels)，进而可能导致移码并引起基因破坏甚至是基因敲除；(2)单链退火(SingleStrandAnnealing,SSA)，这种机制是同源重组的一种特殊情况，即在DSBs两边有一定的正向重复序列(DirectRepeatsequences,DRs)的情况下，断裂DNA分子直接通过SSA机制修复，在删除一个DR及中间包含的序列的情况下实现基因修复；(3)同源重组(HR)，即断裂DNA分子在有与之同源的序列存在的情况下，可以通过同源重组机制来修复，所谓的同源的序列可以是姐妹染色单体、同源染色体或者是包含同源臂的外源供体DNA，在哺乳动物细胞中发生DSBs的同源重组效率要比没有DSBs时的自发重组提高1000～50000倍。综上所述，利用基因编辑技术可进行动物育种乃至将来应用于人类的基因治疗，简单来说就是在真核生物的基因组中的某位点引入DSB并提供相应的供体模版，让其按照人们的意愿进行精确编辑，从而实现快速动物育种或者基因治疗的目的。可以看出HR方式的高效修复直接影响目的位点的精确编辑，而NHEJ这种优势修复方式也会伴随HR修复方式同时存在且与HR互为竞争。提高HR的效率、降低NHEJ的效率是基因编辑研究工作的重中之重；同时，进行基因编辑相关工作的科研人员也迫切的希望知道当人为的针对真核细胞基因组中某一特定的靶位点引入人工核酸酶及相应供体后，该位点发生NHEJ和HR的效率分别是多少？当断裂位点的两段含有合适的重复片段序列时，同时发生SSA的效率又究竟是多少？为了快速的对真核细胞基因组中断裂位点处发生的不同种修复方式的效率进行量化，需要构建报告细胞系或报告载体系统对修复效率进行量化。报告细胞系是将报告基因直接整合到细胞的基因组中，当核酸酶作用于靶序列时，可以通过报告基因的表达来反映修复效率的高低。报告细胞系的优点是靶序列整合到基因组中，和靶细胞基因组的情况类似，效率接近且稳定。但是由于哺乳动物基因组不易操作，将含靶序列的报告基因整合入基因组难度大，费时费力，并且一种细胞系只能检测一个或几个核酸酶的活性，有一定的局限性。而报告载体系统是游离于细胞染色体之外，将核酸酶表达系统、供体模版和报告载体系统共转染至细胞中，通过载体系统中的报告基因的表达来间接的反映真核细胞中各通路的修复效率。报告载体的靶序列虽然不能完全等同于基因组中靶序列的环境，但也有其自身明显的优势，例如构建方便快捷，靶序列易于改变，不需要整合入基因组，并且通过荧光标记或者药物筛选标记对阳性细胞进行分选实现对目的细胞的收集。因此，报告载体相对于报告细胞系有更为广泛的应用价值。现在还没有发现将同种报告基因利用其不同修复方式整合到一个载体系统中同时反映真核细胞中特定位点各修复通路效率的工具，已知的报告载体系统大都只能独立间接反映真核细胞中某一种通路的修复效率。
技术实现思路
针对上述问题，基于非整合型报告载体系统的优势及科研需求，本专利技术提供了一种快速、高效的基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，包括CRISPR/Cas9表达载体以及双荧光报告系统表达载体；所述CRISPR/Cas9表达载体包括用于表达对目的基因靶位点具有剪切活性的Cas9核酸酶的序列；双荧光报告系统表达载体包括顺次设置的以下元件：插入有目的基因靶位点的报告基因I表达盒、完整的报告基因II表达盒以及报告基因I的截短序列，其中，报告基因I、II具有不同的检测信号，目的基因靶位点的插入位置位于报告基因I的阅读框内并导致该阅读框打断，所述报告基因I表达盒与报告基因I的截短序列的转录方向相同，所述报告基因I表达盒与报告基因II表达盒的转录方向相反，报告基因I的截短序列是本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：包括CRISPR/Cas9表达载体以及双荧光报告系统表达载体；所述CRISPR/Cas9表达载体包括用于表达对目的基因靶位点具有剪切活性的Cas9核酸酶的序列；双荧光报告系统表达载体包括顺次设置的以下元件：插入有目的基因靶位点的报告基因I表达盒、完整的报告基因II表达盒以及报告基因I的截短序列，其中，报告基因I、II具有不同的检测信号，目的基因靶位点的插入位置位于报告基因I的阅读框内并导致该阅读框打断，所述报告基因I表达盒与报告基因I的截短序列的转录方向相同，所述报告基因I表达盒与报告基因II表达盒的转录方向相反，报告基因I的截短序列是仅作为修复模板的自转录起始点截短的报告基因I阅读框片段。

【技术特征摘要】
1.基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：包括CRISPR/Cas9表达载体以及双荧光报告系统表达载体；所述CRISPR/Cas9表达载体包括用于表达对目的基因靶位点具有剪切活性的Cas9核酸酶的序列；双荧光报告系统表达载体包括顺次设置的以下元件：插入有目的基因靶位点的报告基因I表达盒、完整的报告基因II表达盒以及报告基因I的截短序列，其中，报告基因I、II具有不同的检测信号，目的基因靶位点的插入位置位于报告基因I的阅读框内并导致该阅读框打断，所述报告基因I表达盒与报告基因I的截短序列的转录方向相同，所述报告基因I表达盒与报告基因II表达盒的转录方向相反，报告基因I的截短序列是仅作为修复模板的自转录起始点截短的报告基因I阅读框片段。2.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述CRISPR/Cas9表达载体包括顺次设置的抗性筛选基因表达盒、目的基因靶位点sgRNA序列表达盒和hSpCas9基因表达盒。3.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述报告基因I选自荧光蛋白报告基因GFP，所述报告基因II选自荧光蛋白报告基因DsRed。4.根据权利要求1或3所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述报告基因I表达盒包括顺次设置的EF1a启动子、位于目的基因靶位点插入位置之前的荧光蛋白报告基因GFP阅读框部分GFP-L、目标基因靶位点、位于目的基因靶位点插入位置之后的荧光蛋白报告基因GFP阅读框部分GFP-R以及polyA；所述报告基因II表达盒包括顺次设置的CMV启动子、荧光蛋白报告基因DsRed阅读框以及β-globinpolyA。5.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述双荧光报告系统表达载体还包括抗性筛选基因表达盒。6.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述报告基因I的截短序列为缺少起始密码子的荧光蛋白报告基因GFP阅读框。7.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述细胞为真核细胞。8.基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率...

【专利技术属性】
技术研发人员：张智英，邵斯旻，徐坤，韩芙蓉，沈俊岑，白义春，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61