本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种表达IL12的多顺反子慢病毒载体、慢病毒颗粒，以及其制备与应用。本发明专利技术在2A序列的上游接入IL12a基因，在2A序列的下游接入了IL12b基因，构建为pLVTH-IL12a-2A-IL12b慢病毒载体；该载体与pCMV-dR8.2dvpr、pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞后，在宿主细胞中包装获得带有2A多肽的多顺反子慢病毒颗粒。本发明专利技术为基于FMDV2A多肽的多顺反子慢病毒载体，通过2A多肽的自剪切功能同时表达IL12的两个亚基，IL12a和IL12b，得到有活性的IL12，为基于IL12的基因治疗研究提供了新手段。
【技术实现步骤摘要】
一种表达I LI 2的多顺反子慢病毒载体及其制备与应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种表达IL12的多顺反子慢病毒载体、慢病毒颗粒，以及其制备与应用。
技术介绍
慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒科(Retrovirus)的一个亚科，是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别于一般的逆转录病毒载体，它可以感染分裂细胞及非分裂细胞。慢病毒作为外源基因表达载体有以下优点，慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达；转移基因片段容量较大；目的基因表达时间长；不易诱发宿主免疫反应等。慢病毒克服了其它逆转录病毒载体的一些缺陷，因而成为最理想的基因转移载体之一，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)属于小 RNA病毒科口蹄疫病毒属(Peter W Mason, Marvin J Grubman, Barry Baxt.Molecular basis of pathogenesisof FMDV.Virus Research.2003; I (91):9-32.)。FMDV 基因组编码的蛋白酶 2A 可在翻译过程中形成的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间位阻，导致无法形成正常的肽链连接，但同时核糖体却能继续翻译下游蛋白，从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”。剪切位点位于高度保守的“NPGP”序列的“G”和“P”之间。2A则由于其独特的“剪切”机制，导致最终，2A能起到类似蛋白水解酶的作用，在该位点将一个启动子控制下的氨基酸序列顺式“切开”，分别得到一个融合有2A多肽尾巴的上游蛋白和一个N端带有一个脯氨酸的下游蛋白，独立行使功能。故FMDV 2A自我剪切序列与内部核糖体进入位点(IRES)—样都被应用于多顺反子表达载体的构建，以达到独立表达两段非融合外源蛋白的目的。与IRES相比，FMDV 2A在多顺反子载体构建上有明显的优势，比如，FMDV 2A因结构比较短小对插入的多顺反子序列的容量无苛刻要求，且2A元件所连接的上下游基因的表达平衡性好。这些多顺反子表达系统与不同的病毒载体结合被应用于多种疾病的基因治疗。白细胞介素-12 (IL12)是能够调控固有及适应免疫反应的多活性细胞因子(Grufman P, K rre K.1nnate and adaptive immunity to tumors:1L-12 is required foroptimal responses.Eur J Immunol.2000; 30:1088-1093.),主要来源于单核 / 巨卩遼细胞、抗原递呈细胞和B细胞，是由相对分子质量为40 X IO3 (p40)和35X 103 (p35)两个亚单位经二硫键连接形成的异二聚体糖蛋白，P35和p40两个亚基单独存在时无生物学活性，只有两个亚基以1:1比例结合获得的p70蛋白才具有功能作用(Gubler U, Chua A0, SchoenhautDS, et al.Coexpression of two distinct genes is required to generate secretedbioactive cytotoxic lymphocyte maturation factor.Proc Natl Acad Sci USA.1991 ；88:4143-4147.)。IL-12 的受体 IL-12R 由 β I 链和 β 2 链构成(D.Sieburth, E.ff.Jabs, J.A.Warrington, X.Li, et al.Assignment of genes encoding a unique cytokine(IL12)composed of two unrelated subunits to chromosomes 3 and 5.Genomics.1992 ；14(I):59-62.),有多种存在形式，与IL-12有很高的亲和力。p40与IL-12 β 2链结合，介导Ρ35与β I链结合，后者发挥生物活性。IL-12R存在于激活的T细胞以及静息或激活的NK细胞上，B细胞和静息的T细胞则没有IL-12R表达。IL12的生物学活性表现在其能够促进被激活T细胞的增殖，CD4T细胞向辅助效应Thl细胞的分化及CD8T细胞向CTL细胞的分化。另外，IL12能够增强NK细胞的细胞杀伤活性，并刺激NK细胞和T细胞分泌IFN- Y (Trinchieri G.1nterleukin-12 and the regulation of innate resistance andadaptive immunity.Nat Rev Immunol2003 ;3:133-146.)。IL-12 还能够平衡 Thl/Th2 的应答。IL-12直接激活Thl并抑制Th2 ;IL-12还可以诱导NK细胞和T细胞产生IFN-Y间接调节Thl/Th2 的应答平衡(Manetti R, Parronchi P, Giudizi MG, et al.Natural killer cellstimulatory factor(interleukin 12[IL-12]) induces T helper type I (Thl)-specificimmune responses and inhibits the development of IL-4-producing Th cells.J ExpMed.1993;177:1199-1204.) 0在一些临床肿瘤模型中，IL12疗法能够实现原发肿瘤的消退，抑制肿瘤的远端转移，并且延长荷瘤小鼠的寿命(Noguchi Y, Jungbluth A, RichardsEC, et al.Effect of interleukin 12 on tumor induction by 3-methylcholanthrene.Proc Natl Acad Sci USA.1996;93:11798-11801.Brunda MJ, Luistro L, Warrier RR, etal.Antitumor and antimetastatic activity of interleukin 12 against murinetumors.J Exp Med.1993;178:1223-1230.)。IL12被应用于多种的治疗，IL12也被应用于T细胞，B细胞及NK细胞增殖的治疗。IL12与集落刺激因子GM-CSF结合 可以用于加强多发性骨髓瘤病的治疗。科学家们尝试用重组表达的人IL-12 (rhIL-12)治疗多种B细胞恶性肿瘤实体肿瘤，包括血液相关恶性肿瘤患者在接受自体干细胞移植后。临床前实验结果表明，IL-12疗法治疗小肿瘤的效果比较理想，而对大量而扩散的肿瘤疗效较差。患有血液相关恶性肿瘤的病人在接受高剂量的化疗或自体干细胞移植后，少量的遗留肿瘤病灶，尤其适用于IL-12疗法。临床一期实验表明，适当剂量的IL-12能够显著增强病人外周血主要的淋巴细胞亚群本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达IL12蛋白的多顺反子表达载体，含有IL12蛋白表达序列，其特征在于，所述IL12蛋白表达序列含有5’至3’方向连接的IL12a基因序列，自剪切多肽2A基因序列，以及IL12b基因序列。
【技术特征摘要】
1.一种表达IL12蛋白的多顺反子表达载体，含有IL12蛋白表达序列，其特征在于，所述IL12蛋白表达序列含有5’至3’方向连接的IL12a基因序列，自剪切多肽2A基因序列，以及IL12b基因序列。2.如权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，该多顺反子表达载体由所述IL12蛋白表达序列插入到慢病毒载体获得。3.如权利要求2所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述慢病毒载体为pLVTH。4.如权利要求3所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述IL12蛋白表达序列插入到pLVTH载体的BamH I酶切位点和EcoR I酶切位点之间。5.如权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述IL12蛋白表达序列如SEQID NO:10 所示。6.权利要求1-5任一权利要求所述表达IL12蛋白的多顺反子慢病毒载体的构建方法,为采用自剪切多肽2A连接IL12的两个亚基IL12a与IL12b，构建IL12蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹跃琼，朱向莹，金杨晟，
申请(专利权)人：苏州吉凯基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。