一种基于RNAi技术及rescue原理制备的siRNA和突变型克隆载体制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种利用RNAi技术和RNAirescue原理制备的siRNA和突变型克隆载体。本发明专利技术的降低SPP1基因表达的小干扰RNA序列如SEQIDNO：1-2所示；本发明专利技术的突变型克隆载体针对前述降低SPP1基因表达的RNAi的靶序列构建。本发明专利技术的方法通过RNAi沉默基因观察功能变化情况，回复突变的载体与RNAi同时感染或转染目的细胞，沉默内源目的基因，通过外源突变型载体表达与内源相同功能的蛋白，经过这样组合处理细胞功能不发生改变；或者将突变型载体导入RNAi沉默后，功能得到回复，证明功能表型是由此基因引起的，为基因功能研究提供了一种新的模型和方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于RNAi技术及rescue原理制备的siRNA和突变型克隆载体
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于RNAirescue原理制备突变型克隆载体的方法。
技术介绍
RNAi（RNAinterference，RNA干扰）是一种高效的特异性强的基因阻断技术，通过切断目的基因mRNA达到沉默目的基因的作用，RNAi技术是一种新兴的基因研究工具，目前已经被广泛常规应用于各种领域的基因功能研究。随着研究深入发现RNAi存在比较普遍的脱靶现象，为了证实沉默的是否为靶基因，人们采用不同的RNAi靶点证实获得相同的基因功能结果来证明对目的基因进行了特异性沉默，但这种方法存在所设计的RNAi靶点均发生脱靶的几率，如果所设计的RNAi靶点均发生脱靶，则无法证明对目的基因是否进行了特异性沉默。另一种方法就是构建RNAitarget区突变体，即对该区的碱基序列进行同义突变，一方面不被RNAi沉默，一方面能保证表达的蛋白与内源、野生型载体表达的蛋白功能一致，该方法被称为RNA干扰回复（即：RNAirescue）技术。通过RNA干扰回复技术对基因表达进行回复，如果回复的结果和RNAi的结果相反，则可以确认该基因功能。RNA干扰回复方法在设计上更加科学，也更加严格。对于RNA干扰回复的应用目前报道不多，其主要原因在于获得突变型过表达载体的关键技术不够成熟。
技术实现思路
本专利技术的目的在于构建沉默SPP1基因表达的小干扰RNA，以及针对该RNAi的靶序列构建的突变型克隆载体，该突变型克隆载体能够避免RNAi沉默，同时该突变型克隆载体能够表达正常功能的蛋白；两者结合可用于SPP1基因功能的研究。本专利技术首先提供了一种降低SPP1基因表达的小干扰RNA（siRNA），包括正义链和反义链，序列如下：正义链：5’-CCAUUCUGAUGAAUCUGAU-3’（SEQIDNO:1）；反义链：5’-AUCAGAUUCAUCAGAAUGG-3’（SEQIDNO:2）。进一步的，本专利技术所述小干扰RNA针对的SPP1基因上的RNA干扰靶序列如SEQIDNO：3所示。一种降低SPP1基因表达的shRNA，所述shRNA含有SEQIDNO：1所示序列的正义链片段和SEQIDNO：2所示序列的反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构。进一步的，所述降低SPP1基因表达的shRNA可剪切成前述含有如SEQIDNO：1所示正义链以及SEQIDNO：2所示反义链的降低SPP1基因表达的siRNA。优选的，所述茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。一种SPP1基因干扰慢病毒载体，含有编码前述降低SPP1基因表达的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA，并剪切获得如SEQIDNO：1-2所示序列的siRNA。所述SPP1基因干扰慢病毒载体是将编码前述SPP1基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述SPP1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述SPP1基因小干扰RNA，用于特异性沉默SPP1基因的表达。进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。最优选的，所述慢病毒载体为pGCL-GFP。一种SPP1基因干扰慢病毒，由前述SPP1基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。本专利技术第二方面公开了一种SPP1基因突变型克隆载体，针对前述降低SPP1基因表达的siRNA的RNA干扰靶序列突变获得；该突变型克隆载体含有突变的RNA干扰靶序列，并编码RNAitargetmRNA区第三个碱基同义突变的SPP1基因mRNA。优选的，所述突变型克隆载体含有SPP1蛋白表达序列，其特征在于，所述突变型克隆载体的SPP1蛋白表达序列中含有突变的RNA干扰靶序列，并能编码RNAitargetmRNA区第三个碱基同义突变的SPP1基因mRNA；所述RNA干扰靶序列为权利要求1-2任一权利要求所述siRNA所针对的RNA干扰靶序列；所述RNAitargetmRNA区为所述RNA干扰靶序列区段所对应并编码的mRNA。所述RNAitargetmRNA区为RNA干扰靶序列区段所对应并编码的mRNA。本专利技术突变型克隆载体表达的SPP1蛋白序列可参考GeneBank（NM_000582.2）。本专利技术所述RNAitargetmRNA区第三个碱基同义突变是指将目的基因RNA干扰靶序列中，所有编码氨基酸的三联密码子中的第三个碱基进行同义突变，使其碱基序列改变但表达的氨基酸种类不变。优选的，所述突变的RNA干扰靶序列为5’-TCACTCCGACGAGTCCGAC-3’（SEQIDNO：4）。即采用SEQIDNO：4所示突变的RNA干扰靶序列替换掉SEQIDNO：3所示RNA干扰靶序列，从而使SPP1基因RNAitargetmRNA区发生同义突变。更优选的，所述突变型克隆载体含有SEQIDNO：23所示突变的SPP1基因序列。本专利技术突变型克隆载体的关键在于通过分子克隆的方法在目的基因的RNAitarget序列的所有编码氨基酸的三联密码子中的第三个位置的碱基进行同义突变，使其碱基序列改变但氨基酸不变，通过碱基同义突变后获得的克隆载体具有不被RNAi沉默又能表达正常功能蛋白的特性。本专利技术还公开了前述突变型克隆载体的方法，包括下列步骤：目的基因RNAi有效靶点设计、构建shRNA载体；RNAitargetmRNA区第三个碱基同义突变；多重PCR获得含同义突变的目的基因全长mRNA；突变型克隆载体构建；突变型克隆载体构建成功证明；回复功能实验证实细胞克隆形成。本专利技术最后一方面公开了前述降低SPP1基因表达的小干扰RNA，前述突变型克隆载体在SPP1基因功能研究中的应用。本专利技术制备的突变型载体不被RNAi干扰沉默，能表达出功能与野生型载体相同的蛋白；它是研究基因功能的良好模型，对内源基因进行沉默，外源基因导入后不被沉默。同时，本专利技术通过RNAi沉默基因观察功能变化情况，回本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降低SPP1基因表达的小干扰RNA，包括正义链和反义链，所述正义链和反义链序列分别如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种SPP1基因突变型克隆载体，含有SPP1蛋白表达序列，其特征在于，所述突变型克隆载体的SPP1蛋白表达序列中含有突变的RNA干扰靶序列，并能编码RNAitargetmRNA区第三个碱基同义突变的SPP1基因mRNA；所述RNA干扰靶序列为一种降低SPP1基因表达的小干扰RNA所针对的RNA干扰靶序列；所述小干扰RNA包括正义链和反义链，所述正义链和...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹跃琼，朱向莹，金杨晟，
申请(专利权)人：苏州吉凯基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：