本发明专利技术涉及一种PTEN基因干扰shRNA3，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明专利技术还提供了含有PTEN基因干扰shRNA3的重组腺病毒载体以及构建方法和用途。本发明专利技术选择RNAi技术，成功构建了pAdxsi-GFP-PTEN-shRNA载体，并经过培养扩增获得滴度为1.2×1010PFU/ml的干扰重组腺病毒，可降低PTEN基因的表达，PTEN低表达降低了VLDL组装分泌，从而造成了细胞内TG的蓄积，从而促进肝细胞中脂肪的聚集。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种PTEN基因干扰shRNA3，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本专利技术还提供了含有PTEN基因干扰shRNA3的重组腺病毒载体以及构建方法和用途。本专利技术选择RNAi技术，成功构建了pAdxsi-GFP-PTEN-shRNA载体，并经过培养扩增获得滴度为1.2×1010PFU/ml的干扰重组腺病毒，可降低PTEN基因的表达，PTEN低表达降低了VLDL组装分泌，从而造成了细胞内TG的蓄积，从而促进肝细胞中脂肪的聚集。【专利说明】PTEN基因干扰shRNA3和重组腺病毒载体及构建
本专利技术属于动物分子生物学和基因工程领域，涉及一种PTEN基因干扰shRNA3和重组腺病毒载体及构建。
技术介绍
围产期奶牛脂肪肝是因围产期奶牛能量负平衡导致的代谢性疾病，但因没有有效的防治措施给养牛业带来了巨大的损失，寻找一种有效的治疗方法迫在眉睫。鉴于围产期奶牛(特别是荷斯坦品种奶牛)肝脏氧化脂肪酸的能力弱，合成和分泌脂蛋白能力不足是脂肪肝发生的主要环节，建立调控肝脏脂肪酸氧化和VLDL分泌与合成的基因疗法，或许能为围产期奶牛脂肪肝的防治提供新思路。憐酸酶张力蛋白同系物(Phosphoatase and tensin homolog, PTEN)是迄今发现的第一个具有双重特性磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，通过对细胞内多条信号转导通路的负性调控，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移，诱导肿瘤细胞凋亡，对维持细胞的正常生理活动发挥重要作用。PTEN的抑癌功能一直是肿瘤发生发展中的研究热点。然而，近来越来越多的研究发现:PTEN通过其脂质磷酸酶、蛋白磷酸酶及其不依赖于磷酸酶的生物活性，在脂肪肝脏的发生和发展方面发挥着重要的作用。最近几年，对PTEN基因及其蛋白的研究已经延伸至其他领域，而不再仅仅局限于肿瘤。肝脏是机体内重要的新陈代谢器官，在正常机体内，PTEN基因及其蛋白有相对较高的表达。PTEN基因及其蛋白的异常表达除了会在肝细胞癌中出现，也在其他肝脏疾病发生的重要调节。分子生物学技术，在研究生物学功能和疾病治疗等方面发挥着重要的作用，尤其是RNAi技术近年来得到了很大的应用，使用该技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。( I) RNAi技术的选择基因功能研究进入了后基因组时代，需要一种完美有效的研究方法进行基因功能分析。现如今，基因沉默技术包括三种类型:同源重组、随机插入突变和RNA干扰。RNAi技术，特异性降解相应序列的mRNA，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能型缺失的现象，属于转录后水平的基因沉默(post-transcript gene silencing, PTGS)。从1990年第一次被报Napoli和van der Krol等报道后,就广泛的应用于植物、低等动物和哺乳动物的基因功能分析。主要是通过小于38nt双链RNA (dsRNA)抑制哺乳动物细胞基因的表达，而介于38nt到1662nt大小的RNAsq不能有效抑制基因表达，主要是因为大于38nt的dsRNA可引起哺乳动物细胞的死亡。通常使用21-23nt大小的小干扰RNA (siRNA)进行操作，能获得比较好的干扰效果。尤其是因其高效性、特异性和稳定性的优点，可有效的阻断特定基因的表达而广泛被应用于哺乳动物基因功能的研究。它即适用于单个基因或基因通路功能研究，也适用于疾病(包括遗传性疾病)和病毒作用等关键基因功能的研究，还可以通过RNAi发现诱导疾病发生的关键新基因。所以RNAi已成为基础医学和生物医学研究的主要技术，将广泛应用于临床实践中，包括某些癌症、家族遗传疾病、自身免疫疾病和病毒感染性疾病的治疗。与其他治疗方法相比，RNAi技术最大的优势是可以全面的作用于靶目标，包括一些药物不能作用的靶组织或者靶蛋白，可通过改变几个核苷酸序列来影响与疾病发生相关的等位基因的表达。另外RNAi技术已逐渐应用到脂肪代谢领域，RNAi可以通过控制循环血脂水平，来调节像肌肉和肝脏等组织的脂肪酸代谢，从而调控全身代谢和对胰岛素的敏感性。VPuri等开发的RNAi筛选，可以确定培养的脂肪细胞中哪些基因是调节胰岛素关键通路的信号。如筛选出可以识别转录共抑制因子RIP140，RIP140减少可增加了基因簇的表达，可影响对葡萄糖的摄取、糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸氧化、线粒体生物合成和氧化磷酸化。而没有RIP140的小鼠高脂肪饲料耐受，体重增加同时葡萄糖耐受增强。(2) RNAi有效片段的筛选RNAi主要是通过dsRNA参与指导，以外源和内源mRNA为降解目标，将与靶基因的mRNA同源互补的dsRNA导入细胞，特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失的技术。但外源性siRNA如何能导入哺乳动物细胞，是今年来研究的热点和重点。寻找一种安全高效引入体内的方法成为试验成功的基础保障。 RNAi的核心机制主要是双链RNA分子(dsRNA)，通过抑制翻译或mRNA降解引发基因沉默。dsRNAs是在Dicer酶的作用下所产生的长度为21_22nt的一系列片段的总称，包括三种类型:小RNA (miRNAs)，短干扰RNA (siRNAs)和短发夹RNA (shRNAs)。miRNAs是一种内源性的小双链RNA，大约由22个核苷酸组成，可通过抑制转录后翻译抑制mRNA翻译成蛋白，被认为是植物和动物基因表达关键基因调控因子。siRNA分子是19-30bp的合成双链RNA，通过与mRNA靶序列的互补序列进行配对，引起mRNA降解，导致特异性的基因沉默。shRNAs是与miRNA结构类似的一类双链RNA，可以在体外合成后直接导入细胞，也可通过载体转染进入细胞。现在研究RNAi的主要方法之一是直接将合成的siRNA转染进入细胞，另一种是通过载体表达shRNA。第一种方法存在着一定的缺点，除转染效率不稳定比较低以外，其在细胞内作用持续时间也 比较短，作用也会逐渐消失。而DNA载体能够稳定大量的表达短发夹RNA(shRNA)，shRNAs末端在体内被加工、处理成约21bp的类siRNA分子，siRNA将启动RNAi。此方法也大大提高转染效率，增加了实验结果的可靠性。(3)重组腺病毒的选择应用现代转染shRNA进入细胞的方法主要是以载体形式，转染效率是否高效稳定是决定实验成败的关键所在。用质粒进行转染，一是脂质体转染效率低，而且费用高昂；二是对细胞毒性比较大，尤其是在进行体内转染的时候，效果十分不理想。而腺病毒为解决这一难题提供了保障。目前存在腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等基因传递载体系统，每种载体都有它特有的优势和缺点。腺病毒对大多数细胞，包括分裂和不分裂细胞及原代细胞都具有感染效率，感染效率几乎能达到100%，同时它携带进入宿主细胞内的基因不会不整合到宿主细胞，不干扰宿主细胞基因的表达。但腺病毒也具有自身的缺点，主要是进行重组腺病毒的构建和包装步骤比较繁琐，要求的也比较高，操作起来较其他两种载体系统要复杂的多。而逆转录病毒与腺病毒相比，对细胞的转染效率要差的很多，对大多数细胞种类的的感染效率都比较低，一般都不超过30%，从而影响实验效果，尤其是本实验使用的原代培养的肝细胞转染效果会更差。同本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种PTEN基因干扰shRNA3，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：付世新，罗春海，贺显晶，沈冰蕾，郭景茹，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：
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