TRADD基因过表达慢病毒在抑制皮肤疤痕形成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了TRADD基因过表达慢病毒在抑制皮肤疤痕形成或治疗皮肤疤痕中的应用，并具体公开了TRADD基因过表达慢病毒的制备方法。本发明专利技术的TRADD基因过表达慢病毒能同时改善皮肤疤痕的平整度和色泽均匀度。

【技术实现步骤摘要】
TRADD基因过表达慢病毒在抑制皮肤疤痕形成中的应用
本专利技术属于生物制药领域，具体而言涉及TRADD基因过表达慢病毒在抑制皮肤疤痕形成中的应用。
技术介绍
人TRADD基因含有4个外显子，外显子总长度为939bp，可编码大小为34KD信号蛋白——肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(tumornecrosisfactorreceptorassociateddeathdomainprotein，TRADD)，该蛋白可通过肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactoralpha，TNF-α)介导的信号通路调控细胞的增殖与凋亡。TNF-α与TNFR1结合后，TNFR1胞内段的死亡结构域(deathdomain，DD)即可与TRADD蛋白结合，产生2种不同的诱导调节机制(1)TRADD与FADD，caspase-8结合，再激活caspase-3，诱导细胞凋亡；(2)TRADD结合TRAF(TNFreceptorassociatedfactors)或招募RIP(receptorinteractingprotein)，激活NF-κB，活化的NF-κB可抑制细胞凋亡和促进炎症反应。有学者研究和我们的研究证实TRADD蛋白在HSFb中的表达量明显降低，抑制了其在TNF-α／TNFR1信号通路中介导的细胞凋亡作用，导致HSFb的过度增殖。目前皮肤斑痕的治疗有手术疗法和非手术疗法两大类。手术切除是临床治疗皮肤斑痕的常用方法，软组织扩张术、皮片、皮瓣等修复技术的应用，明显改善了病损部位的外观和功能，但复发率较高，很可能因术后创伤愈合失控而导致病理性瘢痕再次形成。非手术疗法包括加压疗法、局部药物注射、激光疗法、冷冻治疗等，任何非手术疗法，均直接或间接作用于抑制成纤维细胞增殖和调节胶原代谢这一重要环节，方法虽多，效果却不尽如人意。加压疗法由于治疗疗程较长，患者不易坚持；皮质类固醇激素仅适用于小面积的病理性瘢痕；激光治疗的局限性主要是其穿透性不足，治疗的深度不够；冷冻治疗的限制因素是疼痛、延迟愈合及感染。瘢痕一旦产生就无法完全消除，因此预防HS的形成尤为重要，只有通过寻找瘢痕基因缺陷并从基因水平加以修正，从源头上抑制成纤维细胞增殖及胶原蛋白合成，避免或减轻HS的发生发展，才是预防HS的核心问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种抑制皮肤疤痕形成中的TRADD基因过表达慢病毒，为了实现本专利技术的目的，拟采用如下技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术提出的方案为一种抑制皮肤疤痕形成中的TRADD基因过表达慢病毒，该TRADD基因过表达慢病毒通过如下方法制备得到：1.TRADD基因过表达慢病毒在抑制皮肤疤痕形成或治疗皮肤疤痕中的应用，其特征在于所述的TRADD基因过表达慢病毒通过如下方法制备而成：(1)TRADD基因为模板，采用PCR法扩增目的片段，扩增引物序列为：TRADD-F：5’-CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCAGCTGGGCAAAATG-3’；TRADD-R：5’-CCATGGTGGCGAATTCGGCCAGGCCGCCATTGG-3’；PCR产物回收纯化后与EcoRI酶切线性化的表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro进行重组连接，37℃孵育15min，再50℃孵育15min，立即转化DH5a感受态细胞，最后将已转化的感受态细胞转移至含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养16h；(2)接种阳性克隆，保种并分装100μl进行测序，测序验证无误后，接种抽提质粒；(3)选择生长状态良好的293FT细胞进行包装：取慢病毒表达载体pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro3μl、virapowerpackingmix9μl轻柔混合于1.5ml无血清Opti-MEMI中，形成溶液A；将36μlLipofectamine2000与1.5ml无血清Opti-MEMI混合形成溶液B，并室温孵育5min；再将溶液A和B混合，室温孵育20min，形成DNA-Lipofectamine2000复合物，直接转染293FT细胞，转染48h后，收集病毒液。本专利技术另一方面还涉及上述TRADD基因过表达慢病毒及其改善皮肤疤痕的平整度和／或色泽均匀度中的应用。附图说明图1TRADD基因PCR扩增电泳结果，其中：M：标准；1：TRADD；图2重组质粒菌落PCR鉴定，其中1：ddH2O；2：pLVX-EGFP-3FLAG-Puro；M：标准；3-10：pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro；图3慢病毒感染293FT细胞48h后绿色荧光蛋白的表达(×100)，其中a：荧光显微镜观察；b：光镜观察；图4EFb、HSFb中TRADD蛋白表达情况，其中a：EFb中TRADD蛋白表达；b：HSFb中TRADD蛋白表达；图5HSFb和EFb中TRADD蛋白表达水平的变化，HSFb组和EFb组比较，aP＜0.05；图6Westernblot检测慢病毒转染EFb后融合蛋白的表达，其中1：EFb；2：转染pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro的EFb.；图7Westernblot检测慢病毒转染HSFb后融合蛋白的表达，其中1：HSFb；2：转染pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro的HSFb；图8TRADD慢病毒、TNF-α对EFb增殖的影响；图9TRADD慢病毒、TNF-α对HSFb增殖的影响；图10TRADD慢病毒、TNF-α对EFb细胞周期和凋亡的影响，其中a：空白组；b：空白组+TNF-α；c：实验组；d：实验组+TNF-α；图11TRADD慢病毒、TNF-α对HSFb细胞周期和凋亡的影响，其中a：空白组；b：空白组+TNF-α；c：实验组；d：实验组+TNF-α；图12不同部位TRADD表达情况，其中A：皮肤成纤维细胞内TRADD蛋白表达b.皮下成纤维细胞内TRADD蛋白表达；图13经方法不同处理后皮肤愈合情况。具体实施方式：1材料与方法1.1质粒和细胞TRADD基因模板购自OPEN公司，慢病毒表达载pLVX-EGFP-3FLAG-Puro购自上海生博公司，ViraPowerTMLenti-viralPackagingMix购自Invitrogen公司，DH5a感受态细胞、293FT细胞、EFb及HSFb均为本领域常见的细胞类型。1.2主要试剂DL2000DNAMarker、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、Taq酶和dNTP购自TaKaRa公司，EcoRI购自NEB公司，BCAProteinAssaykit购自HyClone-Perce公司、Prestainedproteinmarker购自Ferments公司，RabbitAnti-TRADD购自Abcam公司，GoatAnti-rabbitIgG购自SantaCruz公司，ECL-plus/kit购自Amersham公司，I型胶原(CollagenI)ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，阳性克隆测序由华大基因完成。1.3TRADD目的基因获得与慢病毒表达载体构建以购买的TRADD基因为模板，采用PCR法扩增目的片段。引物序列：TRADD-F5’-CTCAAGCTTCGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
TRADD基因过表达慢病毒在抑制皮肤疤痕形成或治疗皮肤疤痕中的应用，其特征在于所述的TRADD基因过表达慢病毒通过如下方法制备而成：?(1)TRADD基因为模板，采用PCR法扩增目的片段，扩增引物序列为：?TRADD?F：5’?CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCAGCTGGGCAA?AATG?3’；?TRADD?R：5’?CCATGGTGGCGAATTCGGCCAGGCCGCCATTGG?3’：?PCR产物回收纯化后与EcoR?I酶切线性化的表达载体pLVX?EGFP?3FLAG?Puro进行重组连接，37℃孵育15min，再50℃孵育15min，立即转化DH5a感受态细胞，最后将已转化的感受态细胞转移至含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养16h；?(2)接种阳性克隆，保种并分装100μl进行测序，测序验证无误后，接种抽提质粒：?(3)选择生长状态良好的293FT细胞进行包装：取慢病毒表达载体pLVX?TRADD?EGFP?3FLAG?Puro3μl、virapower?packing?mix9μl轻柔混合于1.5ml无血清Opti?MEM?I中，形成溶液A；将36μlLipofectamine2000与1.5ml无血清Opti?MEM?I混合形成溶液B，并室温孵育5min；再将溶液A和B混合，室温孵育20min，形成DNA?Lipofectamine2000复合物，直接转染293FT细胞，转染48h后，收集病毒液。...

【技术特征摘要】
1.TRADD基因过表达慢病毒与TNF-α联合在制备抑制皮肤疤痕形成或治疗皮肤疤痕药物中的应用，其特征在于所述的TRADD基因过表达慢病毒通过如下方法制备而成：（1）TRADD基因为模板，采用PCR法扩增目的片段，扩增引物序列为：TRADD-F：5’-CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCAGCTGGGCAAAATG-3’；TRADD-R：5’-CCATGGTGGCGAATTCGGCCAGGCCGCCATTGG-3’；PCR产物回收纯化后与EcoRI酶切线性化的表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro进行重组连接，37℃孵育15min，再50℃孵育15min，立即转化DH5α感受态细胞，最后将已转化的感受态细胞转移至含氨苄青霉素的LB琼脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭贵勇，袁月，康秀峰，刘云杰，代剑华，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：