微环DNA基因载体组合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种微环DNA基因载体组合物，包括将病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的DNA成分、转基因克隆到载体中，得到的第一微环DNA基因载体，以及将病毒基因组中负责表达病毒组装蛋白质基因克隆到载体中，得到的第二微环DNA基因载体。将这种微环DNA基因载体组合物送入靶细胞内，第一微环DNA基因载体可以表达前基因组RNA，第二微环DNA基因载体可以表达组装蛋白，将前基因组RNA组装形成可以表达所述治疗性转基因产物并具有侵染性的重组病毒。重组病毒可以穿过体内的大部分微血管床屏障，例如肝窦状隙内皮细胞孔，从而可以顺利的感染新的易感细胞，具有较高的投递效率。本发明专利技术还提供上述微环DNA基因载体组合物的应用。

【技术实现步骤摘要】
微环DNA基因载体组合物及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因治疗领域，尤其涉及一种微环DNA基因载体组合物及其制备方法和应用。
技术介绍
基因治疗是治疗很多遗传性、获得性疾病最理想方法，目前已经有很多临床前实验成功的报道。然而，临床上成功的例子却鲜有报道。基因治疗的核心是将治疗载体送入靶细胞，但载体的构建和投送方面，还有若干技术问题有待解决。基因治疗载体可分为两类，即病毒载体和非病毒载体。病毒载体感染细胞的效率很高，但由于其免疫原性和插入性突变，容易引起严重的反应，包括致癌、致命，因而难以被临床接受；此外，制造成本高也是其应用的一大障碍。非病毒载体较安全、经济、转基因的大小无限制，相对于病毒载体具有一 定的优势，但目前还缺乏送入体内细胞的有效手段。全球有超过三亿五千万人，中国有超过一亿人，是乙型肝炎病毒(h印atitisBvirus, HBV)携带者。HBV可诱发肝衰竭、肝硬化及肝癌，导致感染者过早死亡。现有的治疗药物，包括核苷酸类药物、干扰素等，疗效不能持久，需经常或每天给药，价格昂贵且副作用大，应用范围有很大限制。疫苗注射可有效预防乙肝病毒感染扩散产生新带毒者，但对己有带毒者无效。此外，疫苗注射覆盖不全，且有部份受注者不产生保护性免疫反应，故每年仍有大量新病例产生。市场需要一种高效、安全、价廉、方便的新治疗技术与产品。下面通过基因载体表达干扰RNA (interference RNA, RNAi)，治疗HBV感染的研究现状，来说明基因治疗的巨大潜力和现有问题。RNAi是最近发现的、生物细胞内的一种保守的分子机制，可将含有特定结构的双链 RNA (dsRNA)，包括小发夹 RNA (smalI hairpin RNA, shRNA)和微小 RNA (microRNA,miRNA)加工成20 30喊基的RNA,形成RNA诱导的静默复合物(RNA-induced silencingcomplex, RISC),通过与祀mRNA淬火链合(annealing),将其裂解或抑制其翻译,达到阻止蛋白质合成的目的。这是生物调节细胞反应过程、抵抗入侵病毒的普遍机制。科学家们正在做出巨大的努力，试图把这个机制转变成治疗技术，治疗各种疾病。已有很多成功的临床前实验的报道，包括抗癌、抗病毒感染等。目前已经有采用RNAi的方式，在体内、体外抑制HBV病毒复制，并且具有较好的效果的报道(McCaffrey，2003)。但该技术还存在一些问题，因而难以应用于临床，主要包括合成的SiRNA在肝细胞内的存留时间短，需反复给药，成本高；用质粒表达RNAi，在体外短期效果很好，但体内投递，效率不高，仅能到达少部分肝细胞，而HBV可存在于几乎所有的肝细胞，因而疗效不彰；标准质粒(plasmid)的骨架DNA成份(DNA复制起源，包括抗菌素抵抗基因等)，可抑制转基因表达，使质粒很快失去表达功能；病毒载体如AAV，肝细胞感染率很高，对HBV的抑制很完全(Li，2009)，但AAV载体可被宿主体内抗体中和失效，或诱发可致命的宿主免疫反应，同时病毒基因组插入性突变，潜藏着致癌的危险。因此，发展安全、高效的载体技术，是实现用RNAi治疗HBV感染的关键。除了RNAi,反义 RNA(antisense RNA)、诱傅 RNA(decoy RNA)和核酶(ribozyme)也有强效的抗HBV复制的效果。但它们与RNAi —样面临着载体的构筑和有效投送到靶细胞等问题。Chen 等专利技术的微环 DNA (MC)技术(Chen, Z. Y. , et al. , Minicircle DNA vectorsdevoid of bacteial DNA result in persistent and high level transgene expressionin vivo. Mol. Ther. , 2003.),有助于解决上述问题。MC是一个环状表达盒子,不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA，可在体内长期表达高水平的转基因产物。在肝细胞内，HBV病毒基因组也能形成环状的DNA结构，称为共价键密闭环状DNA(cccDNA)。导致HBV感染治疗困难的关键，是cccDNA可在肝内存在多年，且对几乎所有药物不敏感。MC在结构、转基因表达的持久性、细胞内的稳定性上，与HBV cccDNA相同，使MC成为安全、高效的理想载体。然而，MC也存在着投递到体内靶细胞效率不高的问题。仍以治疗HBV感染为例，在正常的血循环途径中，MC需要穿过肝窦内皮细胞孔才能进入到人肝主质细胞中，而传统·的基因载体无法或很难穿过肝窦内皮细胞孔。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种具有较高的投递效率的微环DNA基因载体组合物。此外，还有必要提供一种上述微环DNA基因载体组合物的制备方法和应用。一种微环DNA基因载体组合物，包括第一微环DNA基因载体和第二微环DNA基因载体；所述第一微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述第一微环DNA基因载体包括第一启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子；所述第二微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述第二微环DNA基因载体包括第二启动子和所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因；所述第一微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的基因成分和所述治疗性转基因产物至少两个星期，所述第二微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的组装蛋白至少两个星期，所述病毒的基因成分和所述病毒的组装蛋白可以在哺乳动物细胞内组装形成可以表达所述治疗性转基因产物并具有侵染性的重组病毒。优选的，所述病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分为乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分；所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因为乙肝病毒基因组中负责表达多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分。优选的，所述乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括5’包装信号、3’包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域；所述启动子、所述5’包装信号、所述转基因或转基因表达盒子、所述第一增强子、所述病毒复制调节区域以及所述3’包装信号依次连接。优选的，所述乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域；所述包装信号、所述转基因或转基因表达盒子、所述第一增强子以及所述病毒复制调节区域依次连接，所述病毒复制调节区域和包装信号连接到一起，形成核心蛋白基因的启动子。优选的，所述乙肝病毒基因组中负责表达多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的基因采用变性码序列替代。优选的，所述第二微环DNA基因载体还包括表 达敲下DGCR8基因的RNAi的成分。优选的，所述第一启动子为核心蛋白基因的启动子、第二型多聚酶基因启动子或第三型多聚酶基因启动子；所述第二启动子为第二型多聚酶基因启动子。优选的，所述第一微环DNA基因载体为双链DNA结构，第二微环DNA基因载体为双链DNA结构。一种上述的微环DNA基因载体组合物的制备方法，包括如下步骤步骤一、提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微环DNA基因载体组合物，其特征在于，包括：第一微环DNA基因载体和第二微环DNA基因载体；所述第一微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述第一微环DNA基因载体包括：第一启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子；所述第二微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述第二微环DNA基因载体包括：第二启动子和所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因；所述第一微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的基因成分和所述治疗性转基因产物至少两个星期，所述第二微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的组装蛋白至少两个星期，所述病毒的基因成分和所述病毒的组装蛋白可以在哺乳动物细胞内组装形成可以表达所述治疗性转基因产物并具有侵染性的重组病毒。

【技术特征摘要】
1.一种微环DNA基因载体组合物,其特征在于,包括第一微环DNA基因载体和第二微环DNA基因载体； 所述第一微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述第一微环DNA基因载体包括第一启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子； 所述第二微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述第二微环DNA基因载体包括第二启动子和所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因； 所述第一微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的基因成分和所述治疗性转基因产物至少两个星期，所述第二微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的组装蛋白至少两个星期，所述病毒的基因成分和所述病毒的组装蛋白可以在哺乳动物细胞内组装形成可以表达所述治疗性转基因产物并具有侵染性的重组病毒。2.如权利要求I所述的微环DNA基因载体组合物，其特征在于，所述病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分为乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分； 所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因为乙肝病毒基因组中负责表达多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的基因。3.如权利要求2所述的微环DNA基因载体组合物，其特征在于，所述乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括5’包装信号、3’包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域； 所述启动子、所述5’包装信号、所述转基因或转基因表达盒子、所述第一增强子、所述病毒复制调节区域以及所述3’包装信号依次连接。4.如权利要求2所述的微环DNA基因载体组合物，其特征在于，所述乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域； 所述包装信号、所述转基因或转基因表达盒子、所述第一增强子以及所述病毒复制调节区域依次连接，所述病毒复制调节区域和包装信号连接到一起，形成核心蛋白基因的启动子。5.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈志英，何成宜，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：