本发明专利技术公开了一种Yep非特异性核酸酶、基因、载体、工程菌及应用，所述Yep非特异性核酸酶，所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；本发明专利技术所述的Yep非特异性核酸酶能降解各类PCR扩增产物，单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA，且具有广泛的适用性：耐酸碱、耐冷热、耐化学物质，为该核酸酶的工业化应用打下基础。
【技术实现步骤摘要】
Yep非特异性核酸酶、基因、载体、工程菌及应用(一)
本专利技术涉及一种核酸酶，特别涉及一种Yep非特异性核酸酶、编码基因、载体、工程菌及应用。(二)
技术介绍
核酸酶是以核酸为底物，催化磷酸二酯键水解的一类酶。核酸酶可以分为DNA酶、RNA酶和非特异性核酸酶三类，其中非特异性核酸酶是一类高活性的水解酶，能非特异性地降解几乎所有形式的核酸，包括单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA，且对核酸的序列没有要求。非特异性核酸酶具有许多重要功能，主要体现在以下许多方面：首先，在遗传机制方面，例如避免突变、DNA修复、DNA复制和重组、为生长代谢清除核苷和磷酸、防御外源核酸侵入、参与细胞凋亡等；其次，在疾病的诊断和治疗上，非特异性核酸酶参与细胞成熟、细胞凋亡、抗炎治疗、血管血栓及宿主防御等过程，表现出重要的应用价值；另外，非特异性核酸酶在工业上主要用于生物制品中外源核酸的去除，减少过敏反应，提高安全性。与此同时，非特异性核酸酶还能应用于研制新型的环保生物消毒剂，其能作用于细菌和病毒的遗传物质，裂解DNA或RNA，从而达到杀灭细菌和病毒的目的，与化学消毒剂相比，在理论上对机体无任何毒副作用，不污染环境，是一种理想的潜在的绿色环保抗病毒制剂。目前，国内外使用的非特异性核酸酶主要来源于Merck公司的Benzonaseendonuclease，Benzonase核酸酶是来自Serratiamarcescens，经基因工程改进的核酸内切酶，在广泛条件范围下都能保持很高的活性：在pH6-10及0-42℃保持较高的活性；在1.0mMPMSF、1.0mMEDTA及尿素中保持活性。但该重组蛋白具有信号肽，部分以包涵体形式存在，复性困难，导致其价格昂贵，使其大规模应用受到限制。为此非常有必要开展非特异性核酸酶的相关研究工作。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种Yep非特异性核酸酶、编码基因、载体、工程菌及应用，替代现有非特异性核酸酶，降低成本，扩大了使用范围。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种来源于小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocoliticasubsp.Palearctica)(简称为Y.e.p或Yep)的Y.e.p非特异性核酸酶(或者Yep非特异性核酸酶)，所述酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQNO：2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本专利技术保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。本专利技术涉及一种编码所述核酸酶的基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQNO：1所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本专利技术保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。本专利技术还涉及一种含所述编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为在质粒PET24a(+)的NdeI和XhoI酶切位点插入SEQIDNO:1所示核苷酸序列得到的重组表达载体PET24a-nuc。本专利技术还提供一种由所述重组表达载体转化得到的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌命名为EscherichiacoliBL21starTM(DE3)plysS-SL312，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2014年5月12日，保藏编号为CCTCCM2014198，保藏地址为中国武汉武汉大学。本专利技术所述Y.e.p非特异性核酸酶编码基因在制备Y.e.p非特异性核酸酶中的应用，所述的应用为：构建含有所述Y.e.p非特异性核酸酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养(通常以IPTG为诱导剂)，培养液分离得到含有Y.e.p非特异性核酸酶的菌体细胞。本专利技术涉及一种所述Y.e.p非特异性核酸酶在降解核酸中的应用，所述核酸为超螺旋DNA、线状双链DNA、线状单链DNA、环状单链DNA、或单链RNA的一种(见图1，图2)。本专利技术所述Y.e.p非特异性核酸酶核苷酸序列的获取及高产菌株的构建，具体包括以下步骤：(1)以Y.e.p基因组为模板，利用已知小肠肠炎耶尔森菌(Yersinia.enterocoliticasubsp.Enterocolitica)(简称Y.e.e)非特异性核酸酶基因的保守序列设计简并引物，通过PCR技术扩增出包含Y.e.p非特异性核酸酶的基因片段，进行测序，得到Y.e.p非特异性核酸酶的核苷酸序列，如SEQIDNO:1所示，其对应的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。(2)将Y.e.p非特异性核酸酶基因用NdeI和XhoI进行双酶切，并与同样双酶切的PET24a(+)连接，转化至大肠杆菌BL21starTM(DE3)plysS表达载体，构建基因工程菌，在培养基中加入IPTG诱导表达重组蛋白，即为本专利技术所述的含Y.e.p非特异性核酸酶的菌体细胞。本专利技术所述Y.e.p非特异性核酸酶的酶学性质研究主要包括：用Ni-NTAresin亲和层析分离纯化Y.e.p非特异性核酸酶，以小牛胸腺DNA为底物，研究Y.e.p非特异性核酸酶的最适温度、最适pH和不同离子温度、pH、EDTA和SDS对其活性的影响。研究结果表明：Y.e.p非特异性核酸酶的最适温度为35-40℃；最适pH为7.0；对其酶活影响最大的离子为镁离子，其次为钡离子，钙离子、钠离子、铜离子，低浓度的铁离子、钾离子对其活性也有一定的影响；该酶耐热性较好，80℃处理5h后仍有25％左右的残余酶活；酶的酸碱稳定性较好，在酸性条件下，酶活基本不变，在pH9.8的条件下处理5h后仍有83.3％的残余酶活；低浓度的EDTA和SDS对该酶的稳定性影响较小。本专利技术提供了来源于Yersiniaenterocoliticasubsp.Palearctica(简称为Y.e.p)的非特异性核酸酶基因，并构建了Y.e.p非特异性核酸酶的高产菌株。Y.e.p非特异性核酸酶不仅具有非特异性，而且具有广泛的适用性，可以耐酸碱、耐冷热、耐化学物质，是一种理想的新型工业化核酸酶。本专利技术所述的Y.e.p非特异性核酸酶能降解各类PCR扩增产物，单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA(参见实施例2-(2)底物特异性)，且具有广泛的适用性：耐酸碱(pH3.8-9.8均有较高的酶活，在pH3.8的缓冲液中保温5h后，酶活残留96％，在pH9.8的缓冲溶液中保温5h后，酶活残留83％)、耐冷热(0-100℃均具有酶活，100℃保温5h仍有15％以上的残留酶活)、耐化学物质(120mMEDTA中放置5h残余酶活达87％，6M尿素中有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Yep非特异性核酸酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种Yep非特异性核酸酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。2.一种编码权利要求1所述核酸酶的基因。3.如权利要求2所述编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。4.一种含权利要求2所述编码基因的重组表达载体。5.如权利要求4所述重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在质粒PET24a(+)的NdeI和XhoI酶切位点插入SEQIDNO:1所示核苷酸序列得到的重组表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：石陆娥，唐振兴，李珍华，方秀娟，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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