本发明专利技术涉及一种采用温度诱导生产重组人表皮生长因子(hEGF)的方法。本发明专利技术将PL启动子、OmpA信号肽、hEGF基因串联构建分泌表达质粒，将所述分泌表达质粒转化原核生产菌株，利用该生产菌株进行hEGF生产。该方法表达效率高、表达周期短。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域；更具体地，本专利技术涉及通过采用基因工程方法生产重组人表皮生长因子(rhEGF)。
技术介绍
人表皮生长因子(Humanepidermal growth factor,简称 hEGF),是一种由 53 个氨基酸组成的不含糖基的单链多肽，分子内有三对由6个半胱氨酸组成的二硫键，形成3个分子内环型结构，组成生物活性所必须的受体结合区域，其分子量为6，216道尔顿，等电点(PD 为 4. 6。hEGF是人体中一个重要的细胞因子，是类EGF大家族的一个成员，具有多种生物功能，它可促进外胚层和中胚层细胞，如表皮细胞、成纤维细胞、神经细胞的增殖，并可维持·其生长；在生物体发育中，EGF可促进新生儿齿、骨和各器官的生长；可促进肝细胞再生；可促进胃肠粘膜细胞生长和保护粘膜免受损伤等等。rhEGF在临床上主要应用于⑴促进烧伤、各种外科创伤和手术伤口的愈合；⑵促进外科溃疡的愈合，尤其是糖尿病性溃疡和老烂脚等愈合；(3)用于皮肤、角膜移植；(4)治疗角膜损伤和溃疡；(5)促进胃、十二指肠溃疡愈合。近年来，技术人员还将其用于鳞状细胞癌、皮肤癌的治疗，疗效显著。由于EGF分子内含有三对二硫键，因此对酸、碱、热等理化因素均较为稳定，它是迄今发现的最稳定的多肽。基础研究表明，EGF具有对皮肤表皮基底层细胞的激活作用，能在分子水平上对细胞进行修复和调整，促进皮肤细胞的新陈代谢，并调节细胞中色素的平衡，可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用。正是由于EGF具有上述特性和作用，因此近年来也被应用于化妆品和美容行业。目前，大规模制备重组hEGF (rhEGF)多是采用基因工程的方法，所采用的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统和酵母表达系统等。本专利技术人在先前的研究中，主要将精力放在采用大肠杆菌表达系统分泌表达rhEGF的研究上，并取得了很好的效果，比如，将含有大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子和信号肽的质粒pAE-8，转化大肠杆菌宿主菌YK537，得到工程菌株EE-8。该工程菌株在低磷条件下诱导表达rhEGF，最高表达量为150mg/l (中国专利号CN00127953.X);又如，将化学合成全新设计的phoAspLlO基因及其与hEGF的串联基因，构建表达质粒pBLlOEGF (该质粒含有入噬菌体的启动子)，进而以大肠杆菌BL21 (DE3)作为宿主细胞构建工程菌株BE-2，该菌株采用温度诱导的方式，分泌表达rhEGF至384mg/l (中国专利号CN200510025289. 3)。然而，鉴于市场对于hEGF的需求量很大，本领域还有必要进行更优化的研究，以期进一步提高重组hEGF的产量、简化生产过程或降低生产成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供；以及用于高效表达重组人表皮生长因子的构建物。在本专利技术的第一方面，提供一种用于重组表达人表皮生长因子(hEGF)的构建物，其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件噬菌体1\启动子，OmpA信号肽基因，人表皮生长因子基因。在一个优选例中，所述的噬菌体启动子来源于pBLGlu2 ;和/或所述的OmpA信号肽基因和人表皮生长因子基因的序列如SEQ ID NO :1所示。在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。在另一优选例中，所述的噬菌体1\启动子和OmpA信号肽基因之间具有限制性内切酶EcoRI酶切位点。在另一优选例中，所述的人表皮生长因子基因的下游具有限制性内切酶HindIII酶切位点。在本专利技术的另一方面，提供一种基因工程菌，其包含前面任一所述的构建物。在另一优选例中，所述的基因工程菌是大肠杆菌。在另一优选例中，所述的基因工程菌具有氨苄青霉素抗性。在本专利技术的另一方面，提供一种重组表达人表皮生长因子的方法，包括培养所述的基因工程菌，从而表达人表皮生长因子。在另一优选例中，先在30°C ±2°C (较佳地30±1°C)繁殖基因工程菌至菌体OD660值超过30 ;之后升高培养温度至38.0±0. 5°C (较佳地38.0±0. 2°C )，使基因工程菌中所含噬菌体启动子启动，诱导分泌表达人表皮生长因子。在另一优选例中，诱导表达12±2小时；较佳地12±1小时。在另一优选例中，发酵培养基配方为酵母抽提物20±5g/L，蛋白胨，20±5g/L，氯化钠1±0. 2g/L，无水硫酸镁1±0. 2g/L，氯化铵 2±0.4g/L，硫酸铵 2±0.4g/L，磷酸二氢钠· 3H20 O. 4125 ±O. lg/L，磷酸氢二钠· 12H20 O. 675 ±O. 2g/L，氯化钙 O. 02 ±O. 005g/L，1%维生素 ΒΙΟ. 2±0· 05ml/L,葡萄糖10±2g/L ;或补料培养基配方为葡萄糖650±50g/L,水解酪蛋白100±10g/L。在另一优选例中，在发酵前，进行种子培养，种子培养的条件是30°C ±2°C (较佳地30±1°C )培养12±2小时(较佳地12±1小时)。在另一优选例中，培养7±1小时后开始补料，第I小时补料50ml，第2小时补料70ml，第3小时补料100ml，第4小时补料150ml，第5小时补料220ml ;之后开始诱导表达，同时恒速补料，补料速度240ml/小时。在另一优选例中，诱导表达12±2小时(较佳地12±1小时)后发酵结束。在另一优选例中，发酵结束后，还包括从发酵液中分离人表皮生长因子。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图I、OmpA信号肽基因和人表皮生长因子(hEGF)基因串联基因。图2、分泌表达质粒pBLOmpAEGF构建示意图。图3、阳性克隆核酸电泳图。其中，第I栏为DNA Marker，分子量由下至上分别为100bp、250bp、500bp、750bp、IOOObp和2000bp ;第2栏为阴性对照；第3栏为阳性对照；第4栏为空白；第5栏为阳性克隆。图4、工程菌株BL0E-3发酵曲线图。X轴为发酵时间，Y轴是菌浓度OD66tl和EGF表达量(mg/L) ο具体实施例方式本专利技术人长期致力于改进人表皮生长因子(hEGF)的表达技术，经过深入的研究，揭示了一种新的重组表达方法，将1\启动子、OmpA信号肽、hEGF基因串联构建分泌表达质 粒，将所述分泌表达质粒转化原核生产菌株，利用该生产菌株进行hEGF生产。该方法表达效率高、表达周期短，表达量超过了 450mg/L。术语如本文所用，所述的“表达构建体(或称DNA构建体)”指一种已经通过人为干预修饰，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。如本文所用，“元件”是指对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸，本专利技术中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建物(构建体)。所述的“元件”的序列可以是本专利技术中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如l_30bp,更佳地l_20bp,更佳地I-IObp,更佳地l-5bp),或进行随机或定点突变等来获得。如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于重组表达人表皮生长因子的构建物，其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件：噬菌体PL启动子，OmpA信号肽基因，人表皮生长因子基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钱悦，甘人宝，侯永泰，吴剑英，张倩，周庆玮，冯宝山，丁红珍，杜鹏，
申请(专利权)人：上海昊海生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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