一种重组人表皮生长因子工程菌的构建和筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种重组人表皮生长因子(hEGF)工程菌的构建和筛选方法。主要步骤为：一、由PCR技术获得卡那霉素抗性基因，由化学合成方式获得大肠杆菌cspA基因功能元件；二、对编码SUMO蛋白和hEGF的基因序列，分别进行优化，然后由化学合成获得大量表达的融合蛋白基因序列OPT-SUMO-hEGF；三、将前两步所得片段连入pET21质粒，得到pET-Kan-cspA-SE质粒；四、以上述质粒为模板，构建转座体；五、将转座体转入大肠杆菌Origami?2(DE3)；六、筛选出融合蛋白SUMO-hEGF表达量高的菌株。本发明专利技术得到的菌株基因组稳定，表达的hEGF可溶率高，适合大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种高效胞内可溶表达重组人表皮生长因子 (以下简称为h EGF)工程菌的构建和筛选方法。
技术介绍
人表皮生长因子(Human epidermal growth factor, hEGF)是含有53个氨基酸残基的单链多肽，分子量为6216道尔顿；hEGF序列包含6个半胱氨酸残基,可以形成三对分子内二硫键，这些二硫键稳定了 hEGF的构象，对其发挥生物学功能起到了重要作用。在体内，hEGF诱导上皮发展，促进血管生成，抑制胃酸分泌。在体外，hEGF是成纤维细胞，上皮细胞和内皮细胞的促细胞分裂剂，可以促进表皮细胞的集落形成。目前，hEGF 在医疗和化妆品行业具有广泛的应用。hEGF广泛存在于人的体液中，早期主要从尿液中提取(Starkey，R. H. et al.， Science, 189，800-802，1975)，由于hEGF在体液中的含量很小，直接提取成本很高，目前主要通过基因工程菌表达纯化，常用的方法包括分泌表达和胞内表达。hEGF的分泌表达， 虽然表达量较高，但是hEGF的同质性和完整性受到影响，使得下游的纯化步骤复杂化。而在胞内表达时，现本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人表皮生长因子(hEGF)工程菌的构建和筛选方法，其特征在于重组hEGF工程菌的构建和筛选方法按以下步骤进行：一、通过PCR技术获得卡那霉素抗性基因，通过化学合成方式获得大肠杆菌cspA基因功能元件；二、对编码SUMO蛋白的基因和编码hEGF的基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好性，进行密码子优化，然后进行化学合成获得适合在大肠杆菌中大量表达的序列OPT?SUMO?hEGF；三、将第一步和第二步所得的片段连入pET21质粒中，得到pET?Kan?cspA?SE质粒；四、以pET?Kan?cspA?SE质粒为模板，构建转座体；五、将转座体转入大肠杆菌Origami?2(DE3)；六、筛选出...

【技术特征摘要】
1.一种重组人表皮生长因子(hEGF)工程菌的构建和筛选方法，其特征在于重组hEGF工程菌的构建和筛选方法按以下步骤进行一、通过PCR技术获得卡那霉素抗性基因，通过化学合成方式获得大肠杆菌cspA基因功能元件；二、对编码SUMO蛋白的基因和编码hEGF的基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好性，进行密码子优化，然后进行化学合成获得适合在大肠杆菌中大量表达的序列OPT-SUMO-hEGF ;三、将第一步和第二步所得的片段连入pET21质粒中，得到pET-Kan-cspA-SE质粒；四、以pET-Kan-cspA-SE质粒为模板,构建转座体；五、将转座体转入大肠杆菌Origami 2 (DE3);六、筛选出融合蛋白SUM0_hEGF表达量高的菌株。2.根据权利要求I所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于在适合的PCR反应条件下，获得卡那霉素抗性基因。3.根据权利要求2所述的利用PCR方法获得卡那霉素抗性基因所用的初始质粒为pET42a04.根据权利要求2所述的利用PCR方法获得卡那霉素抗性基因所用的引物序列如下 引物 Kan-1 :5' -ggcaaattagatctcttttctacggggtctgacg-3! (SEQID NO 1)引物 Kan_2 :5' -aatttgcccatatgcgatttcggcctattggtta-3! (SEQID NO 2) 5.根据权利要求I所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于cspA基因功能元件的序列为ggcaaattca tatgaaggaa tggtgtggcc gattaatcat aaatatgaaaaataattgtt gcatcacccg ccaatgcgtg gcttaatgca catcaaattgtgagcggata acaatttgat gtgctagcgc atatccagtg tagtaaggcaagtcccttca agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattcctttaacgcttcaaa atctgtaaag cacgccatat cgccgaaagg cacacttaattattaagagg taatacacca tgaatcacaa aRtRRRatcc aagctttaRRtaatctctgc ttaaaagcac agaatctaag atccctgcca tttggcggggatttttttat ttgttttcag gaaataaata atcgatcgcg taataaaatctattattatt tttgtgaaga ataaatttgg gtgcaatgag aatgcgcaggccctttcgtc tcRCRCctcR aRRcagtctο6.根据权利要求I所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于选用PET21为初始质粒来构建pET-Kan-cspA-SE质粒。7.根据权利要求6所述的选用pET21为初始质粒构建pET-Kan-cspA-SE质粒，该结构构建需要以下步骤通过双酶切和连接，把卡那霉素抗性基因片段插入PET21质粒构建ρΕΤ-Kan质粒；通过双酶切和连接，把cspA基因片段插入ρΕΤ-Kan质粒构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑春阳，王磊，王巍，徐彬，
申请(专利权)人：天津强微特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：