一种快速检测CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子含量的方法。具体采用丁基硅烷键合硅胶反相C4柱的色谱柱；流动相：A为0.1体积%三氟乙酸水溶液，B为0.1体积%三氟乙酸乙腈溶液，0.22μm滤膜过滤，超声脱气10min后使用，变梯度洗脱，极性有机溶剂的浓度为连续性递增：0‑30min由10体积%B升到40体积%B，30‑35min由40体积%B升到90体积%B，35‑36min由90体积%B降到10体积%B，36‑41min维持10体积%B 5min；最后进行含量计算即可。该检测方法准确度高、精密度好，系统适用性、回收率、线性关系、稳定性好。

Method for rapidly detecting content of recombinant human nerve growth factor in CHO cell fermentation liquid

The invention discloses a method for rapidly detecting the content of recombinant human nerve growth factor in CHO cell fermentation liquid. The specific use of butyl silane bond chromatography silica gel reversed-phase C4 column; mobile phase: A 0.1 vol% three fluorine acetic acid aqueous solution, B 0.1 volume% three trifluoroacetic acid acetonitrile solution, 0.22 M filter membrane, ultrasonic degassing 10min after using variable gradient elution, concentration of polar organic solvents for continuous increasing: 0 30min from 10%B up to 40%B Volume Volume 30, volume 35min from 40%B up to 90%B by Volume 35, volume 36min from 90%B down to 10%B 36 41min volume, Volume 10%B 5min to maintain; finally the content can be calculated. The method has high accuracy, good precision, suitability, recovery, linearity and stability.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种快速检测CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子含量的方法。
技术介绍
神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是最早被发现的神经营养因子，是具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，其对多种细胞特别是中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。神经生长因子具有重要的临床价值，目前已被广泛用于中枢以及周围神经系统疾病的治疗中，还具有抗病毒、抗炎、调节人免疫系统、促进伤口修复等非神经系统方面的作用。神经生长因子包含α、β、γ三个亚基，其中β亚基具有完整的生物学活性，目前临床使用的神经生长因子主要来源于小鼠颌下腺提取的鼠神经生长因子（mβNGF）。与鼠神经生长因子相比，重组人神经生长因子（rhβNGF）具有易获得、高产率、高活性、成本低廉与无免疫原性等特点，建立高效、稳定的人神经生长因子重组表达系统具有重要的临床意义和商业价值。随着检测技术的发展，2015版中国药典对注射用鼠神经生长因子的检测方法规定鼠神经生长因子原液和成品的含量检测除可以用传统的Lowry法外，还可以使用ELISA法和分子筛高效液相色谱法（HPLC）法。其中传统细胞发酵液中蛋白含量检测方法为ELISA法，其能高通量地对不同发酵液中蛋白含量进行测定，从而较好地对高产细胞株进行筛选。但神经生长因子较难产生抗体，目前市售的神经生长因子抗体不能与CHO细胞重组的人神经生长因子进行结合，故不能实现CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子含量的ELISA检测。相对于ELISA法，HPLC法具有分析简便快速、浓度线性范围大、定量准确等优点。2015版中国药典和其他公开文献主要使用分子筛HPLC，如张金龙, 任军, 付玲,等. 利用SEC-HPLC测定鼠神经生长因子的纯度[J]. 生物技术通讯, 2013, 24(5):691-694.；白羊, 章永垒, 黄奋飞,等. HPLC检测重组人β神经生长因子原液纯度和含量[J]. 中国新药杂志, 2015, 24(4):400-402.；周志文, 张洪山, 王红卫. 测定神经生长因子含量的方法: CN, CN1982891[P]. 2007.；白海芬, 冯彩丽. 一种神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法: CN, CN104931598A [P]. 2015.。但分子筛HPLC法的分离原理是依据蛋白的分子量大小不同，且对于复杂样品（如重组人神经生长因子CHO细胞发酵液）中分子量相近的蛋白缺乏分离能力。其他公开文献中关于对天然和重组的神经生长因子纯度、含量检测方法还采用反相C18柱，如沙云菲, 黄滔敏, 杨蓓,等. 反相高效液相色谱法测定猪脑提取物中神经生长因子的含量[J]. 复旦学报:医学版, 2005, 32(1):108-109.；姜静, 于淑萍, 姜桂香,等. 两步柱色谱法纯化CHO表达的重组人β神经生长因子(β-rhNGF)[J]. 中国生物工程杂志, 2008, 28(10):84-89。但C18柱疏水性较大，其对小分子的分离效果较好，但对多肽和蛋白的分离效果较差，尤其在复杂的蛋白样品检测中。因此，本领域迫切需要一种检测方法简单、分离度好、结果准确的CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子含量的HPLC快速检测方法。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，如ELISA法中抗体很难与CHO细胞重组的人神经生长因子结合，分子筛、C18柱HPLC法缺乏对复杂样品的快速检测能力等，本专利技术的目的在于提供一种简便、准确的CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子含量的HPLC快速检测方法。为实现上述目的，专利技术人经过大量的试验研究，最终获得快速检测CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子含量的方法，其特征在于，步骤为：1）样品处理：取重组人神经生长因子CHO细胞发酵液，4000rpm离心5min，取上清液，过0.22μm滤膜后进行HPLC检测；2）HPLC检测：色谱柱为丁基硅烷键合硅胶反相C4柱；检测器为紫外检测器；检测波长为280nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样体积为20μL；流动相：A为0.1体积%三氟乙酸水溶液，B为0.1体积%三氟乙酸乙腈溶液，0.22μm滤膜过滤，超声脱气10min后使用，变梯度洗脱，极性有机溶剂的浓度为连续性递增：0-30min由10体积%B升到40体积%B，30-35min由40体积%B升到90体积%B，35-36min由90体积%B降到10体积%B，36-41min维持10体积%B 5min；3）含量计算：以重组神经生长因子CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子主峰峰面积通过重组人神经生长因子标准品标准曲线的线性回归方程进行计算。进一步，所述重组人神经生长因子标准品标准曲线的制备方法为：精确称取重组人神经生长因子标准品配置成1.0mg/ml标准品储备液，再稀释成不同浓度的标准品溶液，取稀释浓度梯度的标准品溶液，20μL体积进样，以神经生长因子主峰峰面积和浓度作线性回归，得出线性回归方程。因市售的神经生长因子抗体不能与CHO细胞重组的人神经生长因子进行结合，故不能实现CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子含量的ELISA检测。同时2015版中国药典和已经公开的文献HPLC方法中的分子筛不能分离神经生长因子和杂蛋白，造成检测结果虚高；而反相C18柱极性大，对蛋白的分离灵敏度较差，不能保证神经生长因子出峰区域无干扰。以上造成实验进度受限，因此导致现有技术没有CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子的有效检测方法，申请人创造性的利用C4柱对重组人神经生长因子进行检测，再通过变梯度方法拉大神经生长因子出峰时间附近的非极性流动相（乙腈）的梯度，取得了极好的应用效果，从而实现不需要进行纯化就可以直接检测CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子含量。本专利技术的检测方法利用C4柱对复杂样品中彼此疏水性差异小的蛋白进行有效分离的能力，通过优选变梯度洗脱方法提高CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子与其它蛋白的分离度，实现以重组人神经生长因子主峰峰面积对其含量进行快速检测。本专利技术相对于现有的HPLC含量检测方法而言，不需要对CHO细胞发酵液进行多步纯化即可直接进行检测，具有简便快捷，灵敏度高，准确性好的特点，能很好地应用于重组人神经生长因子CHO细胞株的筛选和工业化中。本专利技术实施例中，重组人神经生长因子标准品线性回归方程相关系数为0.9999，在0-1.0mg/mL范围内线性良好。该检测方法准确度、高精密度好，系统适用性、回收率、线性关系、稳定性试验等方法学指标均能满足CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子的快速检测。附图说明图1是重组人神经生长因子标准品色谱图。图2是重组人神经生长因子标准曲线图。图3是重组人神经生长因子CHO细胞发酵液色谱图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子含量的方法，其特征在于，步骤为：1）样品处理：取重组人神经生长因子CHO细胞发酵液，4000rpm离心5min，取上清液，过0.22μm滤膜后进行HPLC检测；2）HPLC检测：色谱柱为丁基硅烷键合硅胶反相C4柱；检测器为紫外检测器；检测波长为280nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样体积为20μL；流动相：A为0.1体积%三氟乙酸水溶液，B为0.1体积%三氟乙酸乙腈溶液，0.22μm滤膜过滤，超声脱气10min后使用，变梯度洗脱，极性有机溶剂的浓度为连续性递增：0‑30min由10体积%B升到40体积%B，30‑35min由40体积%B升到90体积%B，35‑36min由90体积%B降到10体积%B，36‑41min维持10体积%B 5min；3）含量计算：以重组神经生长因子CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子主峰峰面积通过重组人神经生长因子标准品标准曲线的线性回归方程进行计算。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测CHO细胞发酵液中重组人神经生长因子含量的方法，其特征在于，步骤为：1）样品处理：取重组人神经生长因子CHO细胞发酵液，4000rpm离心5min，取上清液，过0.22μm滤膜后进行HPLC检测；2）HPLC检测：色谱柱为丁基硅烷键合硅胶反相C4柱；检测器为紫外检测器；检测波长为280nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样体积为20μL；流动相：A为0.1体积%三氟乙酸水溶液，B为0.1体积%三氟乙酸乙腈溶液，0.22μm滤膜过滤，超声脱气10min后使用，变梯度洗脱，极性有机溶剂的浓度为连续性递增：0-30min由10体积%B升到40体积%B，30-35min由...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文宇，白羊，章永垒，陈星，黄奋飞，阮卡，葛平辉，邹有土，马燕玲，陈胜亮，王明灶，
申请(专利权)人：未名生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35