一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建方法，通过提出了一种基于HSV-1作为生长因子载体，构建HSV-生长因子重组体的方法，并且公开了构建方法的具体步骤和相关参数；经过合理本发明专利技术HSV减毒灭活载体可携带高表达4-5倍的生长因子，HSV携带生长因子重组体转染神经元效率高达95％，具有良好的感染性；HSV-神经生长因子治疗外伤性脑损伤有明显疗效，可改进神经功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建方法。
技术介绍
随着建筑交通发展和生活压力大，发生外伤性脑损伤的比例日益增加，目前尚无良好的药物治疗办法。大量的研究发现，一类分子量较小的神经生长因子能有效维持发育中神经元存活，并加速细胞增殖和分化，且能促进损伤神经元的细胞修复和促进神经再生。这种作用在体外较为明显，在体内也有报道，但迄今为止神经生长因子治疗脑损伤仍未广泛展开，存在的主要问题是生长因子组蛋白提取困难，且进入体内后半衰期短，且不易透过血脑屏障，这些问题阻碍了生长因子对中枢神经损伤中临床应用治疗。因此需要建立一种高效表达神经生长因子的释放技术，用于脑损伤的治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建方法，旨在解决生长因子重组蛋白提取困难的问题。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术公开了一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建方法，构建方法以HSV-1作为生长因子载体，构建HSV-生长因子重组体，包括了以下步骤：非复制性HSV-1载体骨架构建：将野生的HSV-1CL-1株利用同源重组方法删除ICP27、ICP4、ICP34.5基因，构建出非复制，低毒性的HSV-1载体，并命名为NX01载体；补偿细胞系筛选及培养：将HSV-1ICP27基因构建到含有新霉素r>筛选标记的质粒，转染Vero细胞系，使用新霉素筛选，获得稳定表达ICP27蛋白的Vero细胞系，并命名为VeroHSV-1CL-1-ICP27细胞系；将HSV-1ICP4基因构建到含有Zeozin筛选标记的质粒，转染VeroHSV-1CL-1-ICP27细胞系，使用Zeozin筛选，获得稳定表达ICP4蛋白的Vero细胞系，并命名为OG01细胞系；pNX-CMV中间质粒构建：分别用PCR扩增位于LAT区的两段相邻的同源序列，根据同源序列设计引物，携带SalI和XbaI酶切位点，通过SalI和XbaI酶切LAT的同源序列将之构建到pSP72质粒上，并命名为pNX质粒；然后CMV启动子根据设计的引物携带SphI和PstI酶切位点，通过SphI和PstI酶切目的基因将CMV构建到pNX质粒上；WPRE元件根据设计的引物携带EcoRI和ClaI，通过EcoRI和ClaI酶切将WPRE元件构建到pNX质粒上；PolyA元件根据设计的引物携带EcoRV和BglII酶切位点，通过EcoRV和BglII酶切将PolyA元件构建到pNX质粒上，并命名为pNX-CMV中间质粒。pNX-CMV-生长因子质粒构建：根据生长因子基因设计引物，携带HindIII和XhoI酶切位点，PCR扩增生长因子基因片段，HindIII和XhoI酶切生长因子基因片段，与同样酶切处理的pNX-CMV中间质粒连接，转化，鉴定出正确的质粒；非复制性HSV-1载体构建：pNX-CMV-生长因子质粒DNA和非复制性HSV-1载体骨架DNA使用磷酸钙共沉淀法共转染OG01细胞系，挑取阳性病毒斑；将PCR验证目的基因重组正确的病毒斑扩大培养，使用凝胶柱纯化，超滤管超滤，获得高滴度，非复制性的HSV-1载体。其中，删除ICP27、ICP4、ICP34.5基因的方法为使用基因敲除或者基因置换，生长因子为大鼠神经生长因子，并且用GFP标记同时克隆入HSV。其中，OG01细胞系使用含有10％NBS、800ug/ml新霉素和700ug/mlZeozin的DMEM培养。本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术通过提出了一种基于HSV-1作为生长因子载体，构建HSV-生长因子重组体的方法，并且公开了构建方法的具体步骤和相关参数。2.经过合理本专利技术HSV减毒灭活载体可携带高表达4-5倍的生长因子，HSV携带生长因子重组体转染神经元效率高达95％，具有良好的感染性；HSV-神经生长因子治疗外伤性脑损伤有明显疗效，可改进神经功能。附图说明图1为本专利技术中HSV-1生长因子重组体构建示意图。图2为本专利技术中HSV-1生长因子重组体在体外、体内表达水平图。图3为本专利技术实施例2中NSS评分结果图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。实施例1如图1所示，本专利技术公开了一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建方法，构建方法以HSV-1作为生长因子载体，构建HSV-生长因子重组体，包括了以下步骤：非复制性HSV-1载体骨架构建：将野生的HSV-1CL-1株使用基因敲除或者基因置换删除ICP27、ICP4、ICP34.5基因，构建出非复制，低毒性的HSV-1载体，并命名为NX01载体；补偿细胞系筛选及培养：将HSV-1ICP27基因构建到含有新霉素筛选标记的质粒，转染Vero细胞系，使用新霉素筛选，获得稳定表达ICP27蛋白的Vero细胞系，并命名为VeroHSV-1CL-1-ICP27细胞系；将HSV-1ICP4基因构建到含有Zeozin筛选标记的质粒，转染VeroHSV-1CL-1-ICP27细胞系，使用Zeozin筛选，获得稳定表达ICP4蛋白的Vero细胞系，并命名为OG01细胞系；pNX-CMV中间质粒构建：分别用PCR扩增位于LAT区的两段相邻的同源序列，根据同源序列设计引物，携带SalI和XbaI酶切位点，通过SalI和XbaI酶切LAT的同源序列将之构建到pSP72质粒上，并命名为pNX质粒；然后将CMV启动子根据设计的引物携带SphI和PstI酶切位点，通过SphI和PstI酶切目的基因将CMV构建到pNX质粒上；WPRE元件根据设计的引物携带EcoRI和ClaI，通过EcoRI和ClaI酶切将WPRE元件构建到pNX质粒上；PolyA元件根据设计的引物携带EcoRV和BglII酶切位点，通过EcoRV和BglII酶切将PolyA元件构建到pNX质粒上，并命名为pNX-CMV中间质粒；pNX-CMV-生长因子质粒构建：根据生长因子基因设计引物，携带HindIII和XhoI酶切位点，PCR扩增生长因子基因片段，HindIII和XhoI酶切生长因子基因片段，与同样酶切处理的pNX-CMV中间质粒连接，转化，鉴定出正确的质粒；非复制性HSV-1载体构建：pNX-CMV-生长因子质粒DNA和非复制性HSV-1载体骨架本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建方法，其特征在于，所述的构建方法以HSV‑1作为生长因子载体，构建HSV‑生长因子重组体，包括了以下步骤：非复制性HSV‑1载体骨架构建：将野生的HSV‑1 CL‑1株利用同源重组方法删除ICP27、ICP4、ICP34.5基因，构建出非复制，低毒性的HSV‑1载体，并命名为NX01载体；补偿细胞系筛选及培养：将HSV‑1 ICP27基因构建到含有新霉素筛选标记的质粒，转染Vero细胞系，使用新霉素筛选，获得稳定表达ICP27蛋白的Vero细胞系，并命名为Vero HSV‑1 CL‑1‑ICP 27细胞系；将HSV‑1 ICP4基因构建到含有Zeozin筛选标记的质粒，转染Vero HSV‑1 CL‑1‑ICP 27细胞系，使用Zeozin筛选，获得稳定表达ICP4蛋白的Vero细胞系，并命名为OG01细胞系；pNX‑CMV中间质粒构建：分别用PCR扩增位于LAT区的两段相邻的同源序列，根据同源序列设计引物，携带SalI和XbaI酶切位点，通过SalI和XbaI酶切LAT的同源序列将之构建到pSP72质粒上，并命名为pNX质粒；然后CMV启动子根据设计的引物携带SphI和PstI酶切位点，通过SphI和PstI酶切目的基因将CMV构建到pNX质粒上；WPRE元件根据设计的引物携带EcoRI和ClaI，通过EcoRI和ClaI酶切将WPRE元件构建到pNX质粒上；PolyA元件根据设计的引物携带EcoRV和BglII酶切位点，通过EcoRV和BglII酶切将PolyA元件构建到pNX质粒上，并命名为pNX‑CMV中间质粒；pNX‑CMV‑生长因子质粒构建：根据生长因子基因设计引物，携带HindIII和XhoI酶切位点，PCR扩增生长因子基因片段，HindIII和XhoI酶切生长因子基因片段，与同样酶切处理的pNX‑CMV中间质粒连接，转化，鉴定出正确的质粒；非复制性HSV‑1载体构建：pNX‑CMV‑生长因子质粒DNA和非复制性HSV‑1载体骨架DNA使用磷酸钙共沉淀法共转染OG01细胞系，挑取阳性病毒斑；将PCR验证目的基因重组正确的病毒斑扩大培养，使用凝胶柱纯化，超滤管超滤，获得高滴度，非复制性的HSV‑1载体。...

【技术特征摘要】
1.一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建方法，
其特征在于，所述的构建方法以HSV-1作为生长因子载体，构建HSV-
生长因子重组体，包括了以下步骤：
非复制性HSV-1载体骨架构建：将野生的HSV-1CL-1株利用同
源重组方法删除ICP27、ICP4、ICP34.5基因，构建出非复制，低毒
性的HSV-1载体，并命名为NX01载体；
补偿细胞系筛选及培养：将HSV-1ICP27基因构建到含有新霉素
筛选标记的质粒，转染Vero细胞系，使用新霉素筛选，获得稳定表
达ICP27蛋白的Vero细胞系，并命名为VeroHSV-1CL-1-ICP27
细胞系；将HSV-1ICP4基因构建到含有Zeozin筛选标记的质粒，转
染VeroHSV-1CL-1-ICP27细胞系，使用Zeozin筛选，获得稳定
表达ICP4蛋白的Vero细胞系，并命名为OG01细胞系；
pNX-CMV中间质粒构建：分别用PCR扩增位于LAT区的两段相邻
的同源序列，根据同源序列设计引物，携带SalI和XbaI酶切位点，
通过SalI和XbaI酶切LAT的同源序列将之构建到pSP72质粒上，并
命名为pNX质粒；然后CMV启动子根据设计的引物携带SphI和PstI
酶切位点，通过SphI和PstI酶切目的基因将CMV构建到pNX质粒上；
WPRE元件根据设计的引物携带EcoRI和ClaI，通过EcoRI和ClaI...

【专利技术属性】
技术研发人员：王廷华，熊柳林，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：云南;53