人成纤维细胞生长因子21重组蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种人成纤维细胞生长因子21重组蛋白及其制备方法和应用，将人成纤维细胞生长因子21重组蛋白编码基因的核苷酸序列与表达载体相连接得到重组表达载体；再将该重组表达载体转化宿主细胞，然后筛选高表达阳性宿主细胞，培养细胞并诱导表达人成纤维细胞生长因子21重组蛋白，收集菌体、破碎、离心、澄清、纯化，得到目标产物人成纤维细胞生长因子21重组蛋白。本发明专利技术还公开了该人成纤维细胞生长因子21重组蛋白在制备治疗代谢疾病药物中的应用。本发明专利技术的人成纤维细胞生长因子21重组蛋白（mFGF21）相比于野生型hFGF21蛋白，活性显著提高，能够更加有效降低糖尿病小鼠体内的血糖水平。

Recombinant human fibroblast growth factor 21 recombinant protein and preparation method and application thereof

The invention discloses a human fibroblast growth factor 21 recombinant protein and preparation method and application thereof, the people and the carrier is connected by a recombinant expression vector expressing a nucleotide sequence of fibroblast growth factor 21 recombinant protein encoding gene; then the recombinant expression vector was transformed into host cells, and screening of high expression of host cells the cultured cells, and induced expression of human fibroblast growth factor 21 protein, cells were collected, crushing, centrifugation, clarification, purification, to obtain the target product of human fibroblast growth factor 21 recombinant protein. The invention also discloses the application of the recombinant protein of human fibroblast growth factor 21 in the preparation of medicine for treating metabolic diseases. Compared with the wild type hFGF21 protein, the recombinant protein of human fibroblast growth factor 21 (mFGF21) has high activity and can effectively reduce the blood glucose level in diabetic mice.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组蛋白领域，尤其涉及一种人成纤维细胞生长因子21重组蛋白及其制备方法，本专利技术还涉及该人成纤维细胞生长因子21重组蛋白在制备治疗代谢疾病药物中的用途，属于成纤维细胞生长因子

技术介绍
糖尿病（diabetes mellitus，DM），是一类由胰腺功能病变的慢性代谢类疾病，以高血糖为主要特征，是一种终身疾病。其发病机理是胰岛素抵抗或胰岛素分泌减少，导致机体糖脂代谢紊乱所致。随着世界人口的老龄化，糖尿病已成为一种常见病、多发病，现已成为继癌症和心脑血管病之后，第三大威胁人类生命的疾病（Nathan DM, et al. Medical management of hyperglycaemia in type 2 diabetes: a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy. Diabetes Care 2009; 32: 193–203. Culy CR, Jarvis B. Repaglinide: a review of its therapeutic use in type 2 diabetes mellitus [J]. Drugs, 2001, 61(11): 1625）。随着经济的日益发展，我国的糖尿病患者数量也呈上升趋势，据调查结果估计，现中国大约有1亿糖尿病患者。目前治疗糖尿病的药物大多数是以胰岛素为核心发挥作用，如胰岛素类制剂或其增敏剂类药物等，但这些药物对有些糖尿病患者特别是II型糖尿病的晚期患者效果仍然不够理想。由于没有可替代胰岛素的药物和更先进的治疗手段，尽管病人对胰岛素产生抵抗作用，导致上述药物无法奏效，胰岛素仍然是治疗II型糖尿病的首选药物。随着胰岛素抵抗作用的不断加剧，胰岛素的疗效逐渐减弱，血糖无法控制在正常水平。由于血糖长期维持在较高水平，从而导致很多严重的并发症，如失明、肾衰、心脑血管疾病和神经系统疾病等。因此II型糖尿病的临床治疗中一直迫切需要一种能取代胰岛素，解决胰岛素抵抗的新型药物。成纤维细胞生长因子（FGF）21属于FGF家族中一名新成员，FGF21基因主要在肝脏和脂肪中表达，FGF21在体外能够促进HepG2细胞和3T3-L1脂肪细胞消耗葡萄糖，在动物体内具有降低血糖和甘油三酯等功能，并且不会产生低血糖和引起肿瘤发生等副作用（Kharitonenkov A, et al. FGF-21 as a novel metabolic regulator. J Clin Invest 2005; 115:1627–35. Kharitonenkov A, et al. The metabolic state of diabetic monkeys is regulated by fibroblast growth factor-21. Endocrinology 2007;148:774–81）。FGF21安全、有效以及不依赖胰岛素调节生物体内血糖水平的特点，使其有望成为治疗II型糖尿病的新型药物。然而，随着对FGF21的深入了解，我们发现野生型人FGF21（hFGF21）的生物学功能及临床应用受到了体内稳定性和自身免疫原性的制约（Huang Z, et al. A better anti-diabetic recombinant human fibroblast growth factor 21 (rhFGF21) modified with polyethylene glycol. PLoS One 2011;6:e20669. Ye X, et al. Enhancement of the pharmacological efficacy of FGF-21 by genetic modification and PEGylation. Curr Pharm Biotechnol 2014;14:1287–98.），故对hFGF21进行改造和修饰将逐渐成为近年来研究的热点。人血清白蛋白（HSA）是由585个氨基酸残基组成的单链无糖基化的球形蛋白质，是人体血清内含量最高的蛋白，分子量为66kDa，第356位的苏氨酸是可能存在O-糖基化位点（He, X.M. and D.C. Carter, Atomic structure and chemistry of human serum albumin. Nature, 1992. 358(6383): p. 209-15.），其在调节血液渗透压和促进伤口愈合等方面起着重要的作用，并且具有人体相容性好、分子量大、半衰期长及无酶活性和免疫原性等优点，这使得白蛋白融合技术在研制长效重组蛋白药物领域倍受关注（Nel, M.R., Human albumin administration in critically ill patients. Critical analysis of original studies has to take place. BMJ, 1998. 317(7162): p. 882.）。很多具有治疗功能的蛋白质，如干扰素、人生长激素和IL-2等，经过白蛋白融合技术的改造后，都可以开发成为具有药效更佳和注射次数减少等优点的重组蛋白药物。白蛋白融合技术的优势在于其不需要额外的化学修饰，生产工艺简单，产物均一，且质量控制相对容易，延长药物半衰期的效果可能要比化学修饰（如PEG修饰和乙酰化等）更有效（Muller, N., et al., Superior serum half life of albumin tagged TNF ligands. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010. 396(4): p. 793-799.）。但在白蛋融合蛋白的表达和储存过程中伴有降解和聚合现象，增加了纯化的难度和临床用药时出现免疫反应的风险（Yao, X.Q., et al., Degradation of HSA-AX15(R13K) when expressed in Pichia pastoris can be reduced via the disruption of YPS1 gene in this yeast. J Biotechnol, 2009. 139(2): p. 131-6. Cordes, A.A., et al., Selective domain stabilization as a strategy to reduce fusion protein aggregation. J Pharm Sci, 2012. 101(4): p. 1400-9. Cordes, A.A., J.F. Carpenter, and T.W. Randolph, Selective domain stabilization as a strategy to reduce human serum albumin-human granulocyte colony stimulating factor a本文档来自技高网...

【技术保护点】
人成纤维细胞生长因子21重组蛋白，其特征在于该人成纤维细胞生长因子21重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。

【技术特征摘要】
1.人成纤维细胞生长因子21重组蛋白，其特征在于该人成纤维细胞生长因子21重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。2.一种权利要求1所述的人成纤维细胞生长因子21重组蛋白编码基因，其特征在于该人成纤维细胞生长因子21重组蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。3.一种含有权利要求2所述的人成纤维细胞生长因子21重组蛋白编码基因的表达载体及含有该表达载体的宿主细胞，其特征在于：所用的表达载体优选为pET30a（+），宿主细胞优选为Rossetta（DE3）。4.一种权利要求1所述的人成纤维细胞生长因子21重组蛋白的制备方法，其特征在于具体步骤为：将人成纤维细胞生长因子21...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶贤龙，齐剑英，仉晓文，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南;41