本发明专利技术公开了一种重组鞭毛蛋白衍生物(辐抗肽)的制备方法及其生物活性的鉴定方法，属于生物产品的生产方法领域。在获得细菌鞭毛蛋白衍生物cDNA之后，将此cDNA插入温度敏感型原核表达载体，构建原核高效表达工程菌，在此基础上建立了一套工程菌的诱导表达、包涵体的分离与裂解、辐抗肽的体外复性和分离纯化工艺。利用此工艺能最终得到具有生物学活性的辐抗肽纯品，实现辐抗肽的工业化生产；本发明专利技术还提供了用于辐抗肽生物学活性的细胞系的建立方法以及辐抗肽活性的鉴定方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于一种生物工程产品的生产方法和活性鉴定方法，具体涉及利用PCR方法构建重组细菌鞭毛蛋白衍生多肽及其表达、分离和纯化的制备方法及其生物学活性的鉴定方法。
技术介绍
研究表明电离辐射主要通过诱导细胞凋亡造成多器官损伤，例如骨髓造血干细胞和肠道上皮细胞等敏感细胞，在电离辐射后发生明显的细胞凋亡现象。如果能在机体受到电离辐射之前或之后短时间内，增强机体细胞尤其是造血干祖细胞和胃肠道上皮细胞的抗凋亡能力，必然会增强机体对辐射的抵抗性(GudkovAV，et al.Radioprotection：smart games with death.J Clin Invest，2010，120：2270-2273)。 有研究发现TLR5(Toll Like Receptor 5)受体的特异性配体-沙门氏菌鞭毛蛋白及功能同源衍生物CBLB502(含有鞭毛蛋白主要功能结构域的重组蛋白，我们称之为辐抗肽)可以和细胞表面的TLR5结合并激活NF-κB信号通路，在不引发急性炎症反应的情况下，减轻射线引起的肠道上皮细胞、血管内皮细胞和造血细胞凋亡，保护细胞免受辐射损伤并促进组织再生，而并没有降低肿瘤的辐射敏感性(Burdelya LG，et al.An agonist of toll-like receptor 5has radioprotective activity in mouse and primate models.Science，2008，320：226-230)。 Toll样受体家族是一类参与病原微生物引起的先天免疫的蛋白家族。TLRs属于模式识别受体，通过病原相关分子模式(Pathogen-Associated Molecular Pattern，PAMP)，特异地识别病原微生物进化中保守的抗原分子，如脂多糖(LPS)、肽聚糖、酵母多糖以及病原微生物的核酸等，从而有效监测病原微生物的入侵以及诱导机体免疫应答反应(Kumar H，et al.Toll-like receptors and innate immunity.BBRC，2009，388：621-625)。此外，TLRs信号激活能够抑制骨髓间充质细胞分化及促进MSC细胞增殖，多个TLR家族成员可以活化影响多种肿瘤细胞生长(Pevsner-Fischer M，et al.Toll-like receptors and their ligands control mesenchymal stem cell functions.Blood，2007，109：1422-1432；Rooban T，Elizabeth J，Umadevi KR，et al.Sociodemographic correlates of male chewable smokeless tobacco users in India：a preliminary report of analysis of National Family Health Survey，2005-2006.Indian J Cancer，2010，47Suppl 1：91-100)。上述这些研究表明，TLR信号通路不仅在病原微生物引起的先天免疫 方面发挥作用，在细胞增殖分化、肿瘤生长等多个方面也发挥重要作用。 TLR5是TLR家族中的成员之一，在胃肠道上皮细胞、单核巨噬细胞、肺上皮细胞和血管内皮细胞及骨髓等组织细胞高表达，研究表明鞭毛蛋白以TLR5依赖方式活化MyD88分子，进一步激活NF-κB信号通路，调节肠道细胞分泌IL-8、TNF-α、IL-1α等细胞因子，参与微生物引起的免疫反应(Wang Y，et a1.Activation of nuclear factor kappaB In vivo selectively protects the murine small intestine against ionizing radiation-induced damage.Cancer Res，2004，64：6240-6246)。Lyudmila等人则进一步发现鞭毛蛋白衍生物-辐抗肽以TLR5依赖方式有效地预防电离辐射引起的小鼠造血细胞、肠道上皮细胞和血管内皮细胞的凋亡，照射前对小鼠皮下注射辐抗肽蛋白，能够有效预防致死剂量γ射线引起的急性放射病，其30天存活率由全部死亡提高到90％以上；对于超致死剂量照射，提前注射辐抗肽同样能将其平均生存时间由7天延长到12天；在灵长类恒河猴身上也表现出类似的辐射保护效果(Burdelya LG，et al.An agonist of toll-like receptor 5has radioprotective activity in mouse and primate models.Science，2008，320：226-230)。经多个照射剂量对比，辐抗肽的防护效果明显好于已有的细胞因子、WR2721等辐射防护剂。Kumar等人和Jarchum等人的研究表明，鞭毛蛋白不仅对电离辐射小鼠具有保护作用，对化学毒物(DSS)处理、细菌和轮状病毒感染小鼠均具有保护作用，并发现这种保护作用与鞭毛蛋白保护肠道上皮细胞凋亡有直接关系(Vijay-Kumar M，et al.Flagellin treatment protects against chemicals，bacteria，viruses，and radiation.J Immunol，2008，180：8280-8284；Jarchum I，et al.Toll-like receptor-5stimulation protects mice from acute Clostridium difficile colitis.Infect Immun，2011)。Jones等人的研究发现，鞭毛蛋白保护电离辐射诱发肠道上皮细胞凋亡与MKP-7(mitogen-activated protein kinase phosphatase-7)分子直接相关。这些特点使得鞭毛蛋白衍生物辐抗肽有可能倍开发成为极具实用价值的抗辐射保护药物。 研究还表明，辐抗肽在肿瘤的放疗和化疗过程中对正常细胞有明显的保护作用而不影响放化疗效果：利用B16黑色素瘤和NIH3T3肉瘤的裸鼠成瘤实验进一步研究发现，鞭毛蛋白及其衍生物辐抗肽不仅没有增强肿瘤组织对放射治疗的抵抗性，而且加快了肿瘤组织的体积缩小，并提高照射后负瘤小鼠的存活率。Lucia S等进一步利用结肠癌DLD-1细胞进行了体内研究，发现在肿瘤周围注射鞭毛蛋白激活TLR5，能明显促进肿瘤组织的坏死，抑制肿瘤生长，这种抑制作用是TLR5受体依赖的，与鞭毛蛋白能够促进肿瘤组织的中性粒细胞侵润和相关的免疫因子的产生相关(Rhee SH，et al.Toll-like receptor 5engagement modulates tumor development and growth in a mouse xenograft model of human colon cancer.Gastroenterology，200本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备重组的细菌鞭毛蛋白衍生多肽(bacterial？flagellin？dervied？peptide)？辐抗肽(FuKangTai)的方法，其特征为利用温度诱导型表达载体在原核细胞中实现重组辐抗肽的高效表达，采用柱上复性的方法在变性剂介导下实现辐抗肽的体外复性，并应用离子交换层析方法获得了纯化的辐抗肽蛋白产物，该方法包括：(1)应用PCR的方法体外合成了辐抗肽的cDNA；(2)将辐抗肽的cDNA克隆代温度诱导型原核表达载体中，构建辐抗肽表达载体；(3)用辐抗肽表达载体转化感受态大肠杆菌，构建辐抗肽基因表达工程菌；(4)30℃条件下培养基因表达工程菌，42℃条件下诱导辐抗肽表达；(5)分离辐抗肽包涵体，用变性剂裂解辐抗肽包涵体；(6)用DEAE阴离子交换层析实现辐抗肽的体外复性；(7)用DEAE阴离子交换层析实现对辐抗肽的进一步纯化。
【技术特征摘要】
1.一种制备重组的细菌鞭毛蛋白衍生多肽(bacterial flagellin dervied peptide)-辐抗肽
(FuKangTai)的方法，其特征为利用温度诱导型表达载体在原核细胞中实现重组辐抗肽
的高效表达，采用柱上复性的方法在变性剂介导下实现辐抗肽的体外复性，并应用离子交
换层析方法获得了纯化的辐抗肽蛋白产物，该方法包括：
(1)应用PCR的方法体外合成了辐抗肽的cDNA；
(2)将辐抗肽的cDNA克隆代温度诱导型原核表达载体中，构建辐抗肽表达载体；
(3)用辐抗肽表达载体转化感受态大肠杆菌，构建辐抗肽基因表达工程菌；
(4)30℃条件下培养基因表达工程菌，42℃条件下诱导辐抗肽表达；
(5)分离辐抗肽包涵体，用变性剂裂解辐抗肽包涵体；
(6)用DEAE阴离子交换层析实现辐抗肽的体外复...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛常辉，王治东，许望翔，李长燕，于淼，詹轶群，杨晓明，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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