本发明专利技术公开了沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法及其用途，是通过沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力进行体现，以沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性、清除自由基动力学和PDDH自由基的活性作为检测指标。本发明专利技术的检测方法稳定，具有测定结果可靠、检测数据重复性较高等优点，测定的结果能较好地反映沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白蛋白的抗氧化和清除自由基的生物活性，并且在对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白本身以及含有沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物制品的活性跟踪方面具有广泛用途，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物活性检测和生物医药领域，具体涉及沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物蛋白的生物活性检测方法及其应用，特别是涉及沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基活性的检测方法及其在制备具有抗氧化和清除自由基功能药物中的应用。
技术介绍
沙门氏菌鞭毛蛋白(Flagellin)衍生物是将沙门氏菌鞭毛蛋白的结构进行改造的产物，它是包括沙门氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸残基和第402-505位氨基酸残基的融合蛋白，可以含有或者不含有包括Tat蛋白转导肽在内的穿膜肽，沙门氏菌鞭毛蛋·白自N端第1-176位氨基酸残基和第402-505位氨基酸残基可通过柔性连接肽连接。美国 Cleveland BioLabs 公司率先制备得到((Burdelya LG, Krivokrysenko VI, et al. Anagonist of toll-like receptor5has radioprotective activity in mouse and primatemodels. Science2008, 320 (5873) :226-230)，命名为 CBLB502 蛋白，申请人在参考 CBLB502蛋白的制备路线基础上进行了部分结构的改造，完成了沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物的制备，命名为CZLC331。经比较，CBLB502和CZLC331两者之间存在微小的序列差异，主要是使用不同的原核表达载体制备时为了提高表达效率和纯化方便而将个别氨基酸进行了微小调整，两者在功能上基本上是一致的。目前已发现沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin的衍生物蛋白具有多种生物活性，例如CBLB502蛋白具有抗放射活性和抗肿瘤活性，CBLB502在放射损伤小鼠模型中对造血系统及胃肠道系统均表现出较显著的保护作用，能够延长高剂量(剂量为14-17Gy) Y射线照射后小鼠的生存时间，提高低剂量(剂量为10-13Gy) Y射线照射小鼠的生存率(BurdelyaLG,Krivokrysenko VI,et al. An agonist of toll-like receptor5has radioprotectiveactivity in mouse and primate models. Science2008，320 (5873) : 226-230)，这些生物活性的研究成果表明沙门氏菌鞭毛蛋白(Flagellin)衍生物具有重要的工业生产价值。Burdelya等在该文献中还公开了 CBLB502蛋白的制备方法,可以通过此方法获得原核表达的CBLB502蛋白，进一步为沙门氏菌鞭毛蛋白(Flage 11 in )衍生物的工业生产奠定了基础。然而，工业生产需要有相应的质量标准和质检体系支持，而目前对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的检测和控制，停留在蛋白的免疫活性(蛋白印迹检测)和蛋白含量的检测，而针对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性，尤其是抗氧化和清除自由基活性，目前尚无相应的活性研究报告和合适的检测方法报道。自由基是机体正常代谢的中间产物(包括但不限于超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等)。自由基在机体内具有很强的氧化反应能力，同时过量的自由基却又易于在机体内与各种生物大分子发生反应而导致细胞和组织氧化损伤。机体内过多的自由基是许多疾病产生的重要原因，因此清除过量自由基已成为防治多种疾病的重要方式。生理状态下，人体内自由基处于产生与清除的动态平衡中，而此平衡主要依靠机体内的抗氧化系统进行维持。机体内过多的自由基是产生氧化应激的重要因素，也是致病的重要原因，如免疫系统相关疾病、神经系统退行性疾病、肿瘤等，因此清除体内过多的自由基或防止过多自由基的产生已成为预防免疫系统、神经系统疾病的重要途径。目前，还没有沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白CBLB502具有抗氧化和清除自由基活性的报道。由此，本专利技术的专利技术人在蛋白水平上对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性(尤其是抗氧化和清除自由基活性)进行系列深入研究，并将研究成果转化为沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白生产的质量标准和质检方法，对于后续工业生产中的质控要求具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵敏度较高的从蛋白水平直接检测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白生物活性的方法。本专利技术所提供的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法， 是通过沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力进行体现，以沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性、清除ABTS自由基动力学和清除DPPH自由基的活性作为检测指标。具体而言，沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法，主要是针对该蛋白总的抗氧化活性进行检测，使用ABTS法进行检测，可包括以下步骤沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法，是通过沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力进行体现，以沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性、清除自由基动力学和TODH自由基的活性作为检测指标，可包括以下步骤I)将待检沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成设定浓度的样品溶液；2)检测样品溶液抗氧化和清除自由基的能力；3)计算出检测数据并与沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性标准数据比较，得出检测结果；所述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白包括但不限于命名为CBLB502和CZLC331的蛋白。所述检测方法中，针对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性进行检测，用ABTS法进行检测，包括以下步骤I)制作标准曲线按照ABTS检测方法制作ABTS浓度与吸光度A735的标准曲线；2)将待测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白样品配成lmg/mL的样品溶液；3)根据标准曲线，按照样品的A735值计算样品与Trolox标准溶液的等摩尔浓度，计算出样品的总抗氧化能力。具体来讲，所述ABTS法进行检测可包括以下过程I)样品检测①将IOmM Trolox 标准溶液稀释成 0,0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8 和 I. OmM ;用双蒸水把待测样品沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成lmg/mL溶液；②取200 μ I ABTS工作液(ABTS与氧化剂K2S2O8按7mM 28mM终浓度配制)，空白对照为 ο μ I双蒸水或PBS，标准曲线检测分别加入10 μ I各个浓度的Trolox标准溶液，样品检测加入10 μ I沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白溶液，轻轻混匀，室温孵育2_6分钟后测定A735 ；③根据测定的空白对照和标准溶液的A735值，绘制出横坐标为溶液浓度、纵坐标为A735值的标准曲线，根据标准曲线和样品的A735值计算样品与Trolox标准溶液的等摩尔浓度，进而用下述方法计算出样品的总抗氧化活性；2)计算样品总的抗氧化活性总抗氧化活性的表示方式在采用Trolox作为标准品进行抗氧化能力检测时，样品的抗氧化能力用Tr本文档来自技高网...
【技术保护点】
沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法，是通过沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力进行体现，以沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性、清除自由基动力学和PDDH自由基的活性作为检测指标，可包括以下步骤：1)将待检沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成设定浓度的样品溶液；2)检测样品溶液抗氧化和清除自由基的能力；3)计算出检测数据并与沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性标准数据比较，得出检测结果；所述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白包括但不限于命名为CBLB502和CZLC331的蛋白。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张成岗，李伟光，吴永红，李军怀，高艳，李志慧，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，苏州科景生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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