一种用于抑制基因表达的微核糖核酸载体构建方法技术

本发明专利技术是一种用于抑制基因表达的微核糖核酸载体构建方法，该方法首先利用设计好的反向互补的双链DNA序列的作为模板，经过退火处理后，将退火的双链模板通过T4连接酶连接到质粒载体上，然后再转化到感受态的大肠杆菌DH5α中，通过抗性筛选、酶切鉴定、测序鉴定等获得我们所要表达的miRNA。与现有的其他技术相比，该系统能在各种培养的细胞中有效、持久地表达miRNA，无任何致病作用。本发明专利技术的方法不仅所需设备简单、操作便利，适合各种不同种类的miRNA的表达，而且易于对所需miRNA进行大量的制备，不仅可用于体外实验，实现对基因表达的调控。而且可望用于种癌症、心血管疾病等的新型生物制剂进行开发。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种利用在一段基因片段中构建反向互补重复的双链DNA序列插入到质粒载体里，从而高效表达microRNA (miRNA)的方法，属于基因工程和生物制品研究领域。
技术介绍
miRNA作为21世纪生命科学研究最为重大的发现之一，因其在基因表达调控过程中的重要性，已在短时间内成为了世界科学家研究的焦点，并迅速取得了令人瞩目的进展。这类长度只有 22nt的非编码RNA基因产物，它调节生物体内三分之一的信使RNA(mRNA)的表达。并参与细胞分化、增殖、凋亡、胰岛素分泌以及心脏、大脑、骨骼肌发育以及疾病发生等一系列的生命过程。据研究人员称，miRNA参与人体内包括肿瘤发生在内的多种生物 学过程。在临床研究中对患者进行miRNA水平的检测有可能具有诊断学价值。已有证据表明，与正常组织相比，肿瘤组织内大部分miRNA的表达上升。这些研究结果表明，miRNA有望成为鉴别正常组织和肿瘤组织的biomarker。在肿瘤发生过程中进行miRNA表达谱的鉴定有利于发现基因治疗的新靶点，并提高疾病诊断和预后的正确性。已有的研究表明，miRNA与各种疾病相关，如癌症和一些由病毒感染引发的疾病本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于抑制基因表达的微核糖核酸载体构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤：a.设计微核糖核酸miRNA颈环结构的序列，并采用固相亚磷酰胺三酯法合成该结构的单链寡核苷酸序列；b.将合成的单链寡核苷酸序列退火处理，并且以此作为模板，用于下游的连接反应；c.将退火处理过的模板用T4连接酶连接插入到质粒载体上，然后将载体转化到感受态大肠杆菌中；接种到含有抗生素的LB肉汤培养基中筛选；d.挑取但菌落，酶切、测序鉴定。e.将测序正确的载体转染到细胞中，检测其表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖忠党，梁高峰，刘永平，陈姗姗，陈玲，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：