本发明专利技术公开了一种编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因及其应用。本发明专利技术通过密码子优化筛选，得到如SEQ?ID?NO.1所示的编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因。该基因在CHO细胞中表达量高，且表达出来的蛋白与TNFR的亲和力高。将该基因转入CHO细胞，得到表达重组人TNFR-Fc融合蛋白的细胞。本发明专利技术使用一次性反应器发酵转有该基因的CHO细胞，操作简单，得到的蛋白量较使用传统发酵罐高；特别是在添加补料培养基后，可延长细胞生长时间，提高表达水平，降低生产成本，获得高纯度的目的蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蛋白，特别涉及一种编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因及其应用。
技术介绍
人肿瘤坏死因子(TNF-α )是一种活化的单核/巨噬细胞产生的细胞因子,并具有多种生物学效应。TNF-a能够诱导肿瘤细胞坏死或凋亡，且同时是介导炎症反应的主要细胞因子。研究发现，TNF-a在类风湿关节炎病人的血清中的含量远超过正常人的水平，而其可能的致病机理也被慢慢发现。在关节腔中的TNF含量升高，会产生两方面的作用一方面TNF-a与关节滑膜细胞的受体结合，造成该细胞直接损伤，另一方面，TNF-a可以召集免疫效应细胞聚集至此，分泌更多的细胞因子，产生更强更持久的自身免疫反应。这两方面共同作用，从而造成了类风湿关节炎患者关节部位肿胀和疼痛。·细胞表面存在两种不同的TNFR，即分子量分别为55KD的TNFRI (CD120a)和75KD的TNFRII(CD120b)。人TNF- α与TNFR的亲和力较高，与TNFRI和TNFRII的亲和常数分别为I. 23±0. 23ηΜ和O. 36±0. 13ηΜ。这两种TNFR的膜外区均可脱落，仍然保留结合TNF-α的活性。将受体的膜外区与抗体的Fe段连接，形成的融合蛋白则既可与TNF-α结合，又增加了稳定性，而且通过Fe段可形成二聚体，比天然出现的单体受体对TNF-α有更大的亲和力。重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)是一种由美国FDA批准的，可用于治疗如类风湿性关节炎等自身免疫疾病的蛋白药物。Etanercept (EnbrelTM)是已经上市的商品化的TNFR/Fc融合蛋白，也是抗TNF最有效的药物之一，而生物技术药物中销售额最高的产品正是Amgen公司生产的Enbrel。国内中国中信国建所生产的TNFR-Fc融合蛋白已经获批生产上市，商品名为益赛普，用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎的骨和关节损伤。但是，价格仍相对高昂，因此仍需获得成本较低的生产方法。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因。本专利技术的另一目的在于提供所述的编码重组人TNFR-Fc融合蛋白基因的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因，核苷酸序列如下所示ATGGCCCCCGTGGCCGTGTGGGCTGCCCTGGCCGTGGGACTGGAACTGTGGGCTGCTGCCCACGCCCTGCCCGCCCAGGTGGCCTTCACCCCCTACGCCCCCGAGCCAGGCAGCACCTGCAGGCTGAGAGAGTACTACGACCAGACCGCCCAGATGTGCTGCAGCAAGTGCTCTCCAGGCCAGCATGCCAAGGTGTTCTGCACCAAGACCAGCGACACCGTGTGCGACAGCTGCGAGGACAGCACCTACACCCAGCTGTGGAACTGGGTGCCCGAGTGCCTGAGCTGTGGCAGCAGGTGCTCTAGCGACCAGGTCGAGACCCAGGCCTGCACCAGAGAGCAGAACAGGATCTGCACCTGCAGACCCGGCTGGTACTGCGCCCTGAGCAAGCAGGAAGGCTGCAGGCTCTGCGCCCCACTGAGGAAGTGCAGGCCCGGCTTCGGCGTGGCCAGACCCGGCACCGAGACCTCCGACGTGGTGTGCAAGCCCTGCGCCCCAGGCACCTTCAGCAACACCACCTCCAGCACCGACATCTGCAGGCCCCACCAGATCTGCAACGTGGTGGCTATCCCCGGCAATGCCAGCATGGACGCCGTGTGCACCAGCACCTCCCCCACCAGAAGCATGGCCCCAGGCGCCGTGCACCTGCCCCAGCCCGTGAGCACCAGGTCCCAGCACACCCAGCCCACCCCAGAGCCTAGCACCGCCCCCTCTACCAGCTTCCTGCTGCCCATGGGCCCCAGCCCTCCAGCCGAGGGCAGCACCGGCGACGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCACAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGCAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGCAGCAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGAACTGGCTGGACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCACCCTCTCGAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTG TCCCCCGGCAAGTGATGA ；所述的编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因的应用，是将其重组于CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)表达系统上，在CHO细胞中进行表达；一种重组载体pIRESneo3-TNFR-Fc，通过如下方法制备得到(I)通过基因合成，得到如SEQ ID NO. I所示的编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因；(2)使用引物Fl和引物Rl对步骤(I)得到的基因进行PCR扩增，得到含有AgeI和BamHI酶切位点的基因序列；引物F I :5，-TTCTACCGGTATGGCCCCCGTGGCCGTGT-3，；引物R I :5，-CGCGGATCCTCATCACTTGCCGGGGGACAGGCT-3，；(3)用AgeI酶和BamHI酶分别双酶切步骤(2)得到的含有AgeI和BamHI酶切位点的基因序列和载体pIRESneo3 ;再将双酶切后得到的基因序列和载体pIRESneo3连接，得到重组载体 pIRESneo3-TNFR-Fc ；步骤(I)中所述的基因合成为通过基因合成公司进行合成；步骤(2)中所述的PCR扩增的条件优选为94°C 3分钟；94°C 15秒、57°C 30秒、720C I分钟，34个循环；72°C延伸5分钟；一种转TNFR-Fc基因的CHO细胞，为将上述重组载体pIRESneo3_TNFR-Fc转染到CHO细胞得到；所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码重组人TNFR？Fc融合蛋白的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：熊盛，谢秋玲，洪岸，黄亚东，陈志南，陈慧萍，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
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